【专利孵化项目库】一种针对肿瘤乏氧的PET示踪剂及其制备方法与应
产品介绍
正电子发射计算机断层扫描(Positronemissiontomography，简称PET)在肿瘤 诊断和治疗中的应用主要是因为绝大部分恶性肿瘤存在着对葡萄糖、蛋白质、核酸、氧等物 质具有高代谢或高表达倾向。PET显像技术是将葡萄糖、蛋白质、核酸及其它小分子作为载 体标记上短半衰期的正电子放射性核素(如18F、11C、13N、15O、64Cu或68Ga等)制成示踪剂， 注入人体后随血液循环浓聚到脏器的靶向部位。PET探测系统通过断层扫描采集每个正电 子核素发生湮灭辐射所产生的能量相同(511keV)、方向相反的两个γ光子，并将数据分析 重建进行功能显像。由于PET探测系统具有高灵敏度(fmol)、高分辨率(4-10mm)和可被适当 定量的组织堆积等优势，结合CT或MR的解剖学影像，可从体外无创、定量、动态地显示生物 分子代谢、受体配体特异性结合及神经介质活动等。
乏氧是肿瘤异质性的表现之一。肿瘤细胞以血管为中心呈环状排列，靠近血管的 肿瘤细胞由于氧和营养物质供应充分，细胞增殖迅速。随着肿瘤细胞与血管距离逐渐增大，氧扩散的速率逐渐减慢，氧张力下降，当细胞离血管半径超过200μm，细胞大量坏死形成坏死区。介于这两者之间有一层厚度约10μm～20μm的乏氧区域，诱导细胞周期阻滞及基因突 变，不仅使肿瘤本身更具有侵袭性，而且增加肿瘤细胞对放化疗的抵抗性。因此，在对肿瘤进行治疗前，有必要检测其乏氧程度。采用体外无创伤非侵入性方法评估肿瘤的乏氧性 有重要的临床意义，其中乏氧显像剂的测定在临床应用较广泛。
18F具有接近100％的正电子效率，低正电子能量(0.64M电子伏)和相对较短的物 理半衰期(T1/2＝109.7min)等特点，是理想的PET显像核素。经文献报道的18F标记的PET乏氧显像剂以2-硝基咪唑衍生物为主。硝基咪唑具有亲脂性，很容易从血液扩散到组织中。细胞内硝基咪唑在黄嘌呤氧化酶作用下发生单电子还原，产生阴离子自由基。正常氧水平细胞中，该还原过程可逆，阴离子自由基重新氧化，并扩散到细胞外；而在乏氧细胞中，阴离子自由基可以在硝基还原酶的作用下进一步还原形成更活泼的中间体，与细胞内组分结合并滞留在细胞中。硝基咪唑类乏氧显像剂即利用上述特点使放射性核素浓聚于肿瘤乏氧区域。目前较为常见的硝基咪唑类乏氧组织显像剂包括：18F-氟硝基咪唑(18F-FMISO)、18F-1- α-D-[5’-脱氧-5’-呋喃糖基]-2-硝基咪唑(18F-FAZA)、18F-氟赤硝基咪唑(18F-FETNIM)等， 其中18F-FMISO是应用最广、最具代表性的也是临床上最早的用18F标记的乏氧组织显像剂。
常规地，正电子核素通过连接碳原子结合至载体化合物，或者先标记低比活度试剂，HPLC纯化后缀合至目标肽再次纯化。但是以上方法通常涉及多步合成及纯化，总合成时 间约1-3小时，相对于短半衰期核素无法保证显像时足够的比活度，图像清晰度欠佳。另一方面，现有乏氧显像剂在生物学性质上普遍存在神经毒性和软组织吸收，在肿瘤中浓聚较慢，靶/本底值低。
本发明属核医学领域，涉及一种针对肿瘤乏氧的PET示踪剂及其制备方法和应用。该PET示踪剂是NOTA?Nitro?1经正电子显像核素标记的标记物，所述的NOTA?Nitro?1的化学名为2?[4?(羧甲基)?7?[2?(2?(2?硝基?1H?咪唑?1?基)乙酰氨基)乙基]?1,4,7?三氮杂环壬烷?1?基]乙酸。本发明解决了现有乏氧显像剂标记操作复杂、标记率低的技术问题和亲脂性高的应用缺陷，特别适用于乏氧肿瘤的诊断、治疗及疗效监测等。
专利技术
实施例1：NOTA-Nitro1的制备：
(1)1,4–二(叔丁氧羰甲基)1,4,7-三氮杂环壬烷的制备：溴乙酸叔丁酯(21.4g, 55mmol)溶于CHCl3(100mL)，室温下，用注射泵1h加入1,4,7-三氮环杂壬烷(6.5g,50mmol) 的CHCl3(50mL)溶液中反应24h。过滤，滤液蒸干，加入蒸馏水50mL，用1MHCl调pH至3。以 50mL乙醚萃取3次。蒸干有机层得到1,4,7-三氮杂环壬烷的三叔丁氧羰甲基取代物。水层用 1MNaOH调pH11。以50mLCH2Cl2萃取3次，合并有机相，加入正己烷重结晶，得到二取代产物 1,4–二(叔丁氧羰甲基)1,4,7-三氮杂环壬烷。产率为61％。
(2)2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酸叔丁酯的制备：将2-硝基咪唑1g，溴乙酸叔丁 酯1.8g，碳酸钾1.3g加入20mL乙腈悬浮液中。氮气保护下升温至回流搅拌反应3小时。TLC检 测反应完全，过滤，滤液旋干得到黄色油状物。乙酸乙酯/正己烷重结晶，得到白色固体产物 2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酸叔丁酯。产率约71％。
(3)N-(2-溴乙基)-2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酰胺的制备：将第(2)步的反应产 物2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酸叔丁酯(1.32g,5.8mmol)溶于三氟乙酸(17mL)/二氯甲烷 溶液(39mL)，室温搅拌搅拌3.5h，TLC检测反应完全。旋干后不经处理直接到加入到处理过 的二氯甲烷200mL,DMF20mL。加入溴乙胺溴酸盐1.1g,HATU2g，DIEA5mL。25℃搅拌过夜。 TLC检测反应完全。真空蒸除溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并的有机相，水洗， 5％K2CO3洗涤。5％盐酸洗涤。经干燥，旋干，柱层析得到产物N-(2-溴乙基)-2-(2-硝基-1H- 咪唑-1-基)乙酰胺。产率为32％。
(4)2-{4-[2-(叔丁氧基)-2-羰乙基]-7-[2-(2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酰氨 基)乙基]-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基}乙酸叔丁酯的制备：向三口烧瓶中加入第(1)步的二 取代产物1,4–二(叔丁氧羰甲基)1,4,7-三氮杂环壬烷(715mg,2mmol)，碳酸钾(331mg, 2.4mmol)和10mL干燥乙腈。滴加N-(2-溴乙基)-2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酰胺(665mg, 2.4mmol)的干燥乙腈(7mL)溶液，滴加完毕后，室温搅拌过夜。减压旋去乙腈，搅拌后分层， 有机相无水硫酸钠干燥，旋干。柱层析得到2-{4-[2-(叔丁氧基)-2-羰乙基]-7-[2-(2-(2- 硝基-1H-咪唑-1-基)乙酰氨基)乙基]-1,4,7-三氮杂环壬烷-1-基}乙酸叔丁酯。(CH2Cl2/ MeOH＝9:1)
(5)2-[4-(羧甲基)-7-[2-(2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酰氨基)乙基]-1,4,7-三 氮杂环壬烷-1-基]乙酸的制备：将上一步产物(354mg,0.64mmol)溶于三氟乙酸(2mL)，室温 搅拌4.5小时。蒸干溶剂，乙醚洗涤。加入2mL水，氯仿洗涤。蒸干水相得到纯品(254mg, 90％)。经鉴定，其化学结构式如下式(Ⅰ)所示：
化学名为2-[4-(羧甲基)-7-[2-(2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)乙酰氨基)乙基]-1, 4,7-三氮杂环壬烷-1-基]乙酸，碳谱氢谱数据为：1HNMR(D2O,500MHz):δ7.37(d,1H,J＝1.5Hz),7.16(d,1H,J＝1.5Hz),5.36(s,1H),5.18(s,2H),3.75(s,4H),3.65(t,2H,J＝ 6.0Hz),3.51-3.53(m,4H),3.45(t,2H,J＝6.0Hz),3.35(m,4H),3.18(s,4H)。
实施例2：PET示踪剂18F-FAl-NOTA-Nitro1的制备
(1)18F溶液的制备：医用加速器中采用质子速轰击H218得到18F溶液。采用CRC-15R 活度计(CAPINTEC)测定其放射剂量为20mCi。
(2)PET示踪剂18F-FAl-NOTA-Nitro1的制备：取实施例1制备的前体NOTA-Nitro 10.1mg于西林瓶中，加入10μL冰醋酸、0.005mg三氯化铝(醋酸/醋酸钠缓冲溶液溶解)、200μ L乙腈，继续加入50μL18F离子溶液，与100℃下密闭反应20min，反应结束后冷却至室温再 加入超纯水，让反应液加压通过预先活化好的氯化铝柱，未反应的18F离子被吸附，收集洗 脱液，再加热除去所用溶液，用生理盐水溶解得到目标产物，合成时间约20min。采用CRC- 15R活度计(CAPINETC)测定其放射剂量为10.1mCi，因此，计算其标记率(未校正)为49.4± 3.0％。所述PET示踪剂18F-FAl-NOTA-Nitro1的结构式如下：
采用步骤2中所述的分析型HPLC条件对该示踪剂进行检测，产品保留时间： 15.5min(HPLC图谱见图2所示)，放射化学纯度>95％。
实施例3：MicroPET显像试验
取荷人移植瘤(ECa109食管癌)模型鼠置于小动物PET床板上，异氟烷麻醉模型鼠， 经胶带固定。模型鼠经尾静脉注射上述实施例2制备的示踪剂生理盐水溶液(1.85MBq， 0.2ml)。注射后2小时动态扫描，分别进行MicroPET显像，结果分别如图3所示。
采用二维有序子集期望最大化法进行图像重建。在肿瘤、肌肉、肝等器官用感兴趣区(ROI)法计算放射性活度(MBq/ml)，所得值除以注射剂量获得各组织对PET示踪剂摄取值 (％ID/g)(假定组织密度为1g/ml)。计算结果分别如图4所示。靶/非靶比值(T/M)分别如图5所示。
如图3所示，ECa109食管癌移植瘤在注射后30min到60min均清晰可见。从图中可以 看到，肿瘤与对侧相比具有良好的对比度。
所述PET示踪剂在模型鼠的肾中具有显著的浓聚，这表明其主要通过肾代谢。随着 时间的延长，所述PET示踪剂在模型鼠体内的浓聚逐渐降低，显示所述PET示踪剂逐渐代谢排出体外，这表明所述PET示踪剂是安全的，不会持久的存于鼠体内，且半衰期较短，不会对模型鼠造成伤害。
如图4所示，注射后30-60min，肿瘤对所述PET示踪剂摄取值保持较高水平，约6- 8％ID/g，后随着时间的变化，摄取值逐渐降低。此外，如图5所示，肿瘤较正常组织如肌肉对所述PET示踪剂摄取显著，注射60min后肿瘤与肌肉摄取比值大于3，这有利于获得高清晰度的肿瘤PET图像，便于肿瘤的诊断和治疗。
专利优势
1、对本发明的硝基咪唑类化合物进行正电子核素标记后作为乏氧显像剂，荷瘤鼠microPET显像表明，肿瘤清晰可见，与背景对比度高，尾静脉注射1小时后，瘤肌比大于5，提示特异性结合。实验证实经正电子断层扫描显像，此类显像剂于肿瘤部位浓聚，与18F-FDG图像相比着重显示乏氧区域，并可进行肿瘤乏氧程度的定量分析，为肿瘤肿瘤诊治、预后评估及放疗靶区勾画提供了较可靠的依据。
2、由于本发明的硝基咪唑化合物经标记后与肿瘤乏氧区域高度特异性浓聚且组织渗透迅速，因此具有灵敏、快速的优点。
3、本发明所述的标记方法选用适宜的螯合剂标记，方法简单快捷，标记率和放化纯均可达到满意的效果。
4、本发明所述的方法以HPLC法对标记前体和标记产物进行提纯和纯度分析，不仅分离效果好，且与杂质明显区分。
产品样图
图1
图2
图3
图4
图5
图6
应用科室或临床需求
适用于核医学领域，通过无创观测肿瘤乏氧程度进行肿瘤诊断、治疗及预后评估的PET示踪剂。
商业价值评估
本专利经24家医院，共28名评估专家对其进行了临床价值评估，认为该专利具有一定的临床应用价值，具有一定程度的创新和技术壁垒，当前市场存在一定数量的竞品。依据市场可接受的价格和保守的市场份额估计，建议市场零售价200~500元，因此预计该产品具有一定的盈利能力，但是存在不确定性。厂家操作好该产品需要依靠成熟的渠道能力以及对该产品进行更好的价值挖掘，更详细多维度的临床价值评估报告可以在确定合作后,由江苏省转化医学研究院第三方评价中心提供。
专利保护及设计
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