【现学现卖】PCR ramp rate

昨天写到了一个最近在做的实验【现学现卖】用更少的克隆得到更长的序列，里面最重要的一步是Tag-“PCR”，用的是Promega的GoTaq® Long PCR Master Mix。

根据官网说明书，里面的酶的活性是1000bp/min，所以“PCR”条件，每个循环的72℃延伸12min（推测病毒可能12,000bp），最后再72℃延伸20min。

这本来是一个大概5h的程序，但是为了确保长PCR得到的序列尽可能长，还调节了变温速率（ramp rate），从4℃/s变成2℃/s。然后程序就变成了10h。

关于变温速率

在PCR仪器性能中，变温速率是很重要的热学指标，它可以保证PCR的运行速度。

当然，也不是越快越好，有时候高ramp设定可能会使一些条带P不出来(Derendinger et al., 2018)；并且也不是越慢越好，低的ramp设定可能有引物二聚体和特异性降低等问题。

这些设定根据实验目的和机器性能而变化（是要求特异性还是要求完整度；仪器ramp rate设定有范围，而且模块升温和PCR反应物升温有误差等）。

当实验遇到问题的时候，很多参数和变量都可以考虑，今天想到ramp了，就写写。

参考文献

Derendinger, B., De Vos, M., Nathavitharana, R., Dolby, T., Simpson, J., Van Helden, P. et al. (2018) Widespread use of incorrect PCR ramp rate negatively impacts multidrug-resistant tuberculosis diagnosis (MTBDR plus). Scientific reports 8: 1-8.