CRISPR/Cas9文库筛选原理及步骤

CRISPR/Cas9文库筛选原理：

用于高通量筛选文库的形式主要有阵列文库和混合文库两种。前者将单个或数个sgRNA列于芯片或多孔板中进行处理，每孔中的基因编辑序列已知；后者则是用计算机设计待筛选sgRNA文库并富集阳性克隆，随后转至宿主细胞以引入各种基因突变，最终通过高通量测序等方法获得结果。相比之下，混合文库筛选成本低、操作简单且可用于体内研究，能够更全面地覆盖全基因组，侵染的细胞可在长期培养后检测结果。 CRISPR 文库多使用混合文库形式进行高通量筛选。

CRISPR/Cas9文库筛选的操作流程：

1. 设计合成sgRNA文库
   对于高通量筛选，文库的大小是影响筛选结果的关键因素之一。全基因组文库通常包含超过10万个sgRNA，一方面可以识别更多感兴趣的基因，但另一方面也会耗费大量时间和金钱。
2. 慢病毒载体的构建及感染宿主细胞
   CRISPR/Cas9高通量文库筛选方法中，最关键的步骤是构建慢病毒载体。将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现针对不同sgRNA相对应基因的功能筛选。
3. 阳性或阴性筛选筛选
   工作的另一项重要步骤是选择恰当的筛选策略。根据研究目的不同，CRISPR高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。
4. 高通量测序与生信分析
   利用生物信息学方法寻找候选基因，排除假阳性或假阴性筛选结果，对CRISPR高通量筛选研究结果的后期分析至关重要。从所选的细胞亚群中提取基因组DNA，DNA模板应足量以保证文库的丰度。在提取基因组DNA后对sgRNA的靶向区域进行PCR扩增，随后对这些区域进行高通量测序以量化它们的相对丰度。根据筛选前后的sgRNA相对丰度变化确定sgRNA是被富集还是消耗，从而确定基因型与表型之间的关系。利用生物信息学工具可通过评估同一基因中多个sgRNA的富集水平来确定某一基因是否在相同背景下显著富集。
5. 验证候选基因
   用CRISPR/Cas9技术筛选出若干个候选基因后，需要通过一系列方法进行验证，从而鉴定出调控特定表型的功能基因。首先需分析其脱靶情况，若非靶标位点在外显子内可能导致假阳性结果。候选基因的进一步验证非常必要，使用CRISPR/Cas9技术进行单个基因敲除，通过筛选单克隆细胞构建候选基因敲除细胞系，在基因分型和免疫染色确认基因已被敲除后，检测候选基因敲除对病毒复制的影响，同时可通过遗传互补试验确定其作用是否由基因敲除所致。

需要多少个细胞？
如上所述，通常使用低于 30% 的 MOI 来尝试确保没有细胞感染超过一种病毒粒子（因此不会感染超过一种 CRISPR 靶向序列）。这意味着需要更多的细胞，而不仅仅是被感染的细胞。此外，每个靶向序列必须感染至少 500 个细胞，以确保在检测灵敏度范围内获得结果 [9]。因此，对于包含 100,000 个靶向序列的 CRISPR 文库，建议至少使用 1.67 x 10 8个细胞 [9]。因为文库是合并的，所以细胞在大培养皿中筛选，而不是在多孔板中筛选 [6]。

感染后，会发生什么？
用靶向序列的病毒文库和所需的 Cas 酶处理细胞后，细胞必须孵育几天。这使细胞有时间发展表型 CRISPR 介导的变化——在许多实验中，这意味着细胞要么生长要么死亡（图 1）。然后，如果特定实验需要，则进行药物或其他治疗。此后，收集来自两个混合群体（即对照细胞和药物处理细胞）的总基因组 DNA 样品或总 RNA 样品用于测序。DNA（或 RNA）通过 NGS 进行测序。可以比较两个产生的序列列表（对照与药物治疗）。

CRISPR/Cas9筛选流程

参考：CRISPR/Cas9文库筛选技术的发展及在肿瘤研究中的应用