Western-Blot 常见问题与经验（一）

1.为什么目标蛋白被转移到膜上的量少？

原因：凝胶太厚、蛋白分子量< 10KD、SDS浓度不合适、蛋白的等电点< 9等等。

经验：延长转膜时间、在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率、

更换高pH值Buffer、蛋白分子量<10KD时，减少转膜时间、使用小孔径的膜。

2.为什么背景过高？

原因：抗体浓度过高、膜没有均匀浸湿、封闭不充分、抗体与封闭剂出现交叉反应、膜或者缓冲液受到污染。

经验：杂交前检测一抗、二抗的工作浓度、转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿

检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应、拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液。

3.为什么出现非特异条带？

原因：一抗不是唯一特异的、二抗出现非特异结合。

经验：制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点、设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合。

4.为什么杂交信号很弱？

原因：抗体保存不当、抗原不充足、膜的漂洗过度。

经验：减少漂洗的时间和次数、抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测、

增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照。

5.目的带很弱，怎么加强？

经验：加大抗原上样量、将一抗稀释比例降低。

6.为什么目标带是空白，周围有背景？

原因：一抗浓度过高、二抗HRP 催化活力过强、显色底物处于一个临界点、反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。

经验：将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。