非编码小RNA（microRNA/shRNA/siRNA）介绍及
① 微RNA( microRNA, miRNA)
- 定义：miRNA(microRNA)是一组由基因组编码的长度约20～23个核苷酸的非编码RNA，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。miRNA(microRNA)在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNA(microRNA)大部分在特定的组织和发育阶段表达。miRNA(microRNA)的组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。数据库：https://www.mirbase.org/
-
命名：
- 最早发现的几个miRNA基因根据其表型分别被作者命名为lin-4（第一个发现的miRNA）、let-7（第二个发现的miRNA）、lsy-6，其它发现的miRNA则进行系统命名。
- miRNA(microRNA)成熟体简写成miR，再根据其物种名称，及被发现的先后顺序加上阿拉伯数字，如hsa-miR-122；
- 高度同源的miRNA(microRNA)在数字后机上英文小写字母(a,b,c,…)，如hsa-miR-34a，hsa-miR-34b，hsa-miR-34c等；
- 由不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA(microRNA)，则在后面加上阿拉伯数字以示区分，如hsa-miR-199a-1和hsa-miR-199a-2；
- 通常一个miRNA(microRNA)前体长度大约为70~80nt，很可能两个臂分别产生miRNA(microRNA)。
- 动物：
- miRNA(microRNA)前体：以动物物种缩写+“-”+ mir+“-”+命名顺序，如hsa-mir-122；
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miRNA(microRNA)成熟链：以动物物种缩写+“-”+ miR+“-”+命名顺序，如hsa-miR-122-5p；
MiRNA-biogenesis.jpg
② 干扰小RNA(small inerfering RNA, siRNA)
定义：小分子干扰核糖核酸（英语：small interfering RNA，缩写为siRNA），又译为小干扰核糖核酸。siRNA通常是一段长21个核苷酸的双股RNA（dsRNA），其两股分别在RNA的两端超出另一端2个核苷酸。
SiRNA structure2.jpg
- Dicer：长的双链RNA与Dicer一起形成复合物，双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。
- RISC：随后这些siRNA片段与RISC结合，RISC由Argonaute-2（Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白（TRBP）组成。然后RNA的两条链分开，其中一条链从复合物上分离。5'端双链稳定性最低的那条链被选择出来，稳定的并入沉默复合物中。
- shRNA在被Dicer酶处理前需要经历：shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化转录。在被Exportin-5转运到细胞质之前，这些初始的前体结构需要首先用Drosha及其双链RNA结合伴侣DGCR8加工形成pre-shRNA
2.1. shRNA（Small/short hairpin RNA）
shRNA序列示意图
此为negative control shRNA序列，虽然设计完靶基因的shRNA片段后，但是在后续的实验中，还需要有相应的对照，根据Sigma提供的信息以及文献中的内容，对照通常要做两个，一个是空载体，也就是没有插入shRNA片段的pLKO载体，另外一个就是含有一个没有靶向任何基因的shRNA的载体（sigma官网的货号是SHC002）,但是网上也能查到载体中的这段序列，如下所示：
CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTTG。在构建shRNA慢病毒载体时，就可以使用这个shRNA片段来作为阴性对照。也称为SCR：scrambled shRNA，即不靶向任何基因。
从上面的图上我们可以看出，中间的绿色部分就是最终形成茎环的部分，左侧的红色部分序列是CCGG，与右侧的橘色部分是TTTTTG，这两个序列都是与pLKO-puro载体连接的部分，其中CCGG是AgeI酶切位点的粘性末端，TTTTTG则是保证了shRNA转录出来后，其末端是连续的4个U，即UUUU。蓝色与红色部分的黑色字母标注的部分则是与FLCN的CDS互补的序列。
* 正义链： 5‘ --- CCGG—21bp sense—<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">CTCGAG</mark>（loop）—21bpantisense—TTTTTG --- 3 具体如下图所示
image.png
以FLCN这个基因为例，第1条链基本上都可以在Sigma的官网上查到，现在我们设计第1条shRNA的反义链序列，前面提到，pLK-puro空载体上用于连接shRNA的两个酶切位点是AgeI与EcoRI，因此在设计反义链的时候，需要添加上EcoRI的酶切位点的粘性末端，如下所示：
image.png
- 反义链： 5‘ --- AATTCAAAAA—21bp sense—<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">CTCGAG</mark>(loop)—21bp antisense --- 3’
综上所述，如果构建这个基因最后的正义链和反义链如下：
正义链：5‘ --- CCGGGATGGAGAAGCTCGCTGATTT<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">CTCGAG</mark>AAATCAGCGAGCTTCTCCATC<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">TTTTTG</mark> --- 3’
反义链：5‘ --- AATT<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">CAAAAA</mark>GATGGAGAAGCTCGCTGATTT<mark style="box-sizing: border-box; background-color: rgb(255, 255, 0); color: rgb(0, 0, 0);">CTCGAG</mark>AAATCAGCGAGCTTCTCCATC --- 3‘
miRNA/shRNA/siRNA比较
| miRNA | shRNA | siRNA | |
|---|---|---|---|
| 英文 | microRNA | Small/short hairpin RNA | Small/short interfering RNA |
| 中文 | 微小RNA | 短/小发卡RNA | 小干扰RNA |
| 单双链 | 单 | 双 | 双 |
| 长度 | 20-23nt | 59bp | 21-23nt |
| 需要载体 | 否 | 是 | 否 |
| 需要 | Dicer酶 RISC | Dicer酶 RISC | Dicer酶 RISC |
| 功能 | RNA干扰 | RNA干扰 | RNA干扰 |
