单细胞代谢组-解码细胞代谢异质性

传统代谢组学研究通常需要每个样品有大量的细胞，多细胞样品可以充分检测化学成分，但细胞的异质性被忽略。单个细胞之间的差异可能是遗传，表观遗传，发育和环境因素的结果。即使是克隆或等基因培养物中的细胞也可能由于随机生物学过程而在表型上有所不同。

单细胞代谢组学（SCM）目前是在细胞水平上进行高通量代谢物分析的最强大的工具之一，其在确定单个细胞的代谢谱方面的能力使其非常适合解码细胞代谢层面的异质性，此外，在细胞群落内的细胞类型鉴定和分化方面也具有巨大的潜力。随着各种设备和技术的发展，单细胞代谢分析已可用于各种生物样品。许多领域都采用了这种前沿的分析工具，并产生了富有成效的研究成果。

单细胞代谢组学工作流程

典型的单细胞代谢组学工作流程包括样本收集、样本制备（获得单个细胞或其细胞内容物）、数据采集和数据分析（图1）。

01样本制备方法

常用的样品制备方法包括荧光活化细胞分选（FACS）、微流控阵列以及通过原子力显微镜（AFM）探针直接可视化和穿透/提取。前两种方法保留了整个细胞的原始形态，而最后一种方法仅将细胞代谢物保留在探针中。对于全细胞样品，超声处理可提高检测灵敏度，而从探针直接输送到质谱仪的干扰最小。

02单细胞淬灭

获得单细胞后，应立即使用有机酸或初级溶剂来淬灭细胞代谢，使酶变性，防止代谢物进一步转化为产物。最常见的一种淬灭方法是使用液氮速冻，以停止细胞代谢并促进细胞裂解。具有易操作，不需要额外添加试剂，并且与大多数MS方法兼容的优点。有机溶剂也常用于细胞代谢淬灭。这种方法的优点是所用的有机溶剂也有助于代谢物的提取，其中基于甲醇的淬灭方法是迄今为止最普遍和有效的淬灭策略。

03数据采集

在SCM的所有检测方法中，基于MS的技术脱颖而出，主要包括电喷雾电离质谱（ESI-MS）、基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）、二次离子质谱（SIMS）技术。

a） ESI-MS   一种广泛用于单细胞代谢分析的技术，通常是将样品从探针或毛细管直接输送到质谱仪，只需较少的预处理过程。由于在环境条件下电离，ESI-MS可防止样品破裂。因此，它被广泛用于活的单细胞代谢分析。但其具有相对较低的分辨率和低通量的局限性，使其不适合系统生物学研究。目前可以通过将ESI-MS与毛细管电泳（CE）联合使用以及基于液滴的微萃取与ESI-MS相结合，实现高分辨率和高通量检测。因此，ESI-MS在单细胞代谢研究中具有更广泛的应用潜力。

b） MALDI-MS单细胞代谢分析的常用技术之一，通常是将样品与基质混合，然后使用紫外激光束在真空下进行照射，电离和加速的分析物进入质谱仪进行检测分析。有文献报道MALDI-MS的高通量能够对细胞亚型进行分类并检测细胞群中的单个细胞，也被用于揭示单细胞生物的种群内异质性研究。

c） SIMS   一种相对较新的技术，用于SCM的超高分辨率（<100nm-1μm）研究，将初级脉冲离子束射向样品表面，并使用质谱仪测量喷射的二级离子，其超高分辨率使其适用于分析亚细胞中的代谢物。由于强初级离子剂量，它也可能对较大的有机分子造成损害。此外，SIMS不支持同时进行全扫描和MS / MS分析，并且通量较低，但SIMS仍然是目前最灵敏的单细胞代谢分析方法。

基于上述检测方法，目前在SCM研究中已经鉴定出大量的代谢物。这些代谢物包括氨基酸、磷脂、三羧酸（TCA）循环中间体、核苷酸、脂肪酸和能量代谢物等。

图1 单细胞代谢组学典型工作流程

单细胞代谢组学应用

作为一种不断发展且强大的分析工具，SCM已被广泛应用于各个领域。如在淡水和海洋系统中广泛发现形成多物种群落的不同微藻的生理状态、深入了解脊椎动物胚胎发生早期单细胞代谢异质性的形成等，下面重点介绍下SCM在植物学、神经学和肿瘤学中的应用（图2）。

01植物领域

SCM在植物学中有着广泛的应用，并取得了重要的研究成果。它为植物细胞类型和器官的鉴定和代谢分析提供了机会。单细胞代谢组学进行精确代谢分析的能力有助于提供独特植物功能和有利特征的解释和机制，这将极大地有助于基于这些功能和特征的应用开发，例如创造更适应的作物品种或更有效地提取所需的生物合成化合物。除了细胞和器官代谢分析，SCM也是空间代谢分析的有力工具。总之，考虑到植物学中物种、组织和细胞类型的巨大多样性，在追求更高分辨率的植物研究趋势中，SCM已被证明是解码这种异质性的强大工具。SCM在植物研究中的进展可以进一步有利于实验处理的评估，对有利植物特征的理解，植物发育生物学模型的构建以及植物衍生产品的医学应用。

02神经领域

神经元通常比其他正常细胞大，并且具有非常详细的亚型，疾病或信号引起的神经系统变化通常反映在单个细胞中。因此，SCM在神经学研究中的代谢分析和异质性评估中至关重要且有价值。如Do等人报道脂质和其他代谢物的单细胞分析能有效地对神经元细胞的群体和亚群进行分类，有力地支持了单细胞代谢组学在破译神经元细胞异质性方面的力量，这提供了神经细胞类型之间的更准确的区分，并确定了神经系统中不同细胞类型的特定功能和不同的内部细胞机制。

03肿瘤领域

作为众所周知的肿瘤特征，不同肿瘤和肿瘤亚型之间的异质性长期以来一直对有效治疗构成巨大的挑战。因此，SCM在识别肿瘤类型/亚型方面的潜力可以显著提高肿瘤治疗效率并促进个性化治疗策略的发展。如一项研究报道了使用单细胞代谢数据成功区分乳腺癌亚型，Fang等人的一项研究表明，甘露糖作为兴奋剂可以在单细胞水平上有效改善骨肉瘤细胞与正常人成骨细胞的代谢鉴别。总之，SCM是检测、识别和区分特定肿瘤细胞类型的强大工具，可以显著有益于肿瘤诊断，并针对不同的肿瘤细胞类型进行精确有效的治疗，也可以促进未来针对特定癌症类型的治疗研究。

图2 单细胞代谢组应用

总结

获取单细胞水平的代谢数据具有很多挑战，包括一些重要代谢物的绝对代谢物浓度较低，无法像RNA或DNA那样扩增代谢产物，代谢物的快速转换，以及每个细胞代谢产物浓度的巨大差异。然而，目前已经开发出有效的技术，在单细胞水平上进行高灵敏、高通量的代谢组学分析。随着这些技术的进一步改进和创新，SCM在多个领域开展单细胞分辨率研究方面具有巨大的潜力，并得到了大量研究结果的支持。SCM具有独特的识别和区分具有不同代谢特征的单个细胞的非凡能力，已经帮助解决了以前由于无法单独分析来自同一器官或集群的细胞而引起的问题。它使我们能够了解植物的特征，解码不同神经细胞的特征，对抗肿瘤细胞的异质性等等。为了对我们周围的世界进行更详细和具体的分析，SCM无疑是我们目前拥有的最强大的工具之一。

参考文献

Guo S, Zhang C, Le A. The limitless applications of single-cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 2021 Oct;71:115-122.