RNA绑定DNA和蛋白相互作用的CHIRP实验技术
一、实验原理
免疫共沉淀实验(Chromatin Isolation by RNA Purification, CHIRP)是一种用于研究染色质的空间结构和基因表达调控机制的实验技术。该技术利用RNA探针特异性结合染色质上的RNA分子，通过RNA-蛋白质相互作用实现染色质的分离和富集，进而分析RNA-染色质-蛋白质相互作用网络。
二、实验步骤
1. 细胞交联：使用1%的formaldehyde将细胞交联，通常交联时间为10-20分钟。
2. RNA提取：将交联后的细胞进行裂解，提取RNA，使用biotin化寡核苷酸探针进行RNA的寡核苷酸捕获。
3.免疫共沉淀：将biotin化的RNA探针与细胞提取物进行共沉淀，使用带有亲和标签的抗体捕获RNA-蛋白质复合物。
4. 洗涤和纯化：将共沉淀物进行洗涤，去除非特异性结合的RNA和蛋白质。然后使用热水解的方法将RNA-蛋白质交联断裂，纯化RNA和蛋白质。
5. 分析：对RNA和蛋白质进行分析，例如qRT-PCR、RNA测序、蛋白质质谱等，探究RNA和染色质之间的相互作用。
注意事项：
1. RNA探针的设计需要严格控制其长度、特异性和亲和力。
2. 抗体选择需要根据实验需求进行优化，需要进行负对照和IgG对照。
3. 洗涤过程需要进行充分的洗涤，去除非特异性结合。
4. 热水解的条件需要根据实验需求进行优化。
以上是一般的CHIRP实验步骤，具体实验条件和步骤会因为样本类型、目的和研究问题的不同而有所差异。因此，在进行CHIRP实验之前需要对实验条件进行优化，并且需要谨慎地解释实验结果。
三、实验的应用
免疫共沉淀实验(Chromatin Isolation by RNA Purification, CHIRP)是一种重要的分子生物学实验技术，广泛应用于以下领域：
1. 染色质三维结构研究：CHIRP实验可用于研究RNA在染色质三维结构中的作用，揭示RNA在基因表达调控中的分子机制。
2. RNA-蛋白质相互作用研究：CHIRP实验可用于研究RNA-蛋白质相互作用，进一步探究RNA在蛋白质调控、信号传递等方面的作用。
3.染色质修饰研究：CHIRP实验可用于研究与染色质修饰相关的RNA分子，如Xist RNA与染色体修饰的关系等。
4. 疾病研究：CHIRP实验可用于研究RNA在疾病中的作用，如肿瘤发生、心血管疾病等。
5. 物研发：CHIRP实验可用于筛选和评估RNA-染色质-蛋白质相互作用的靶点，为药物研发提供新的思路和方法。
综上，免疫共沉淀实验(Chromatin Isolation by RNA Purification, CHIRP)在分子生物学、疾病研究和药物研发等领域具有广泛的应用前景。
四、样本要求
免疫共沉淀实验(Chromatin Isolation by RNA Purification, CHIRP)需要高质量的样本，以下是样本要求：
1. 细胞数：CHIRP实验需要大量的细胞数，一般建议使用至少10^7个细胞作为起始样本。对于一些稀有或难以扩增的细胞类型，可以考虑对多个样本进行并行共沉淀。
2. 细胞状态：CHIRP实验对细胞状态的要求较为宽松，可以使用不同的细胞状态或处理后的细胞。但是需要注意的是，不同的细胞状态或处理条件可能会影响RNA-染色质相互作用的结果和解释。
3.RNA交联：CHIRP实验需要对细胞进行RNA-染色质交联，以保持RNA和染色质的相互作用。一般使用formaldehyde进行交联，交联时间和浓度需要根据实验需求进行优化。
[4. 样品保存：CHIRP实验需要高质量的RNA和染色质样品，因此需要注意样品的保存。RNA样品需要避免RNase的污染，可以使用RNase抑制剂加入样品中。染色质样品需要在-80℃冻存，避免反复冻融。
总之，样本质量对于CHIRP实验的结果和解释至关重要，需要注意样本的采集、保存和处理。
五、参考文献
· Chu C, Quinn J, Chang HY. Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP). J Vis Exp. 2012;(61):pii: 3912.
· Rinn JL, Chang HY. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 2012;81:145-166.
· Chu C, Qu K, Zhong FL, et al. Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions. Mol Cell. 2011;44(4):667-678.
这些文献提供了CHIRP实验的详细协议、优化实验条件的指南和实验结果的解释。此外，还有许多其他的相关文献，可以作为参考，以更好地开展和理解CHIRP实验。
