学习一遍ChIPseeker的使用

刘小泽写于2020.5.23-24
Y叔的原文在：https://mp.weixin.qq.com/s/3CMj0xejiV-FSMC-Vxd_-w

0 ChIPseeker的诞生

Y叔一开始使用ChIPpeakAnno进行注释，但使用UCSC genome browser检验结果的时候，发现对不上；另外之前在使用ChIPpeakAnno过程中写了一些可视化函数。后来经过漫长的半夜宿舍苦战，写出了ChIPseeker

1 ChIP-seq简介

ChIP是指染色质免疫沉淀，它通特异结合抗体将DNA结合蛋白免疫沉淀，可以用于捕获蛋白质（如转录因子，组蛋白修饰）的DNA靶点。之前结合芯片就有ChIP-on-chip，后来二代测序加持诞生了ChIP-seq。优点是：不再需要设计探针（探针往往存在着一定的偏向性）

2007年来自三个不同的实验室，几乎是同时间出来（最长差不了3个月），分别发CNS，一起定义了这个ChIPseq技术

• Johnson DS, Mortazavi A et al. (2007) Genome-wide mapping of in vivo protein–DNA interactions. Science 316: 1497–1502
• Robertson G et al.(2007) Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods 4: 651–657
• Schmid et al. (2007) ChIP-Seq Data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell 131: 831–832

主要有4步：Cross-linking、Sonication、IP、Sequencing

简而言之是：DNA和蛋白质交联(cross-linking)、超声(sonication)将染色体随机切割、利用抗原抗体的特异性识别(IP)、把目标蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，反交联释放DNA片段，最后是测序(sequencing)

分析流程示例图1：

Peak calling with MACS2

分析流程示例图2：

image-20200523211551406

原始数据=》质控=》比对=》拿到DNA片段在染色体上的位置信息=》peak calling （去除背景噪音）=》拿到peaks（protein binding site）=》下游分析（可视化、找相关基因、motif分析等等）

2 必须知晓的BED文件

全称是：Browser Extensible Data，为基因组浏览器而生

包括3个必须字段和9个可选字段：

3个必须

• 1 chrom - 染色体名字
• 2 chromStart - 染色体起始位点（起始于0，而不是1）许多软件忽略了这一点，存在一个碱基的位移（如peakAnalyzer, ChIPpeakAnno存在这个问题），Homer、ChIPseeker没有
• 3 chromEnd - 染色体终止位点

9个可选

• 4 name - 名字
• 5 score - 分值(0-1000), 用于genome browser展示时上色。
• 6 strand - 正负链，对于ChIPseq数据来说，一般没有正负链信息。
• 7 thickStart - 画矩形的起点
• 8 thickEnd - 画矩形的终点
• 9 itemRgb - RGB值
• 10 blockCount - 子元件（比如外显子）的数目
• 11 blockSizes - 子元件的大小
• 12 blockStarts - 子元件的起始位点

一般只用前5个足矣（MACS的输出结果也是前5个字段）

第5列score的含义是：the summit height of fragment pileup. 也即是片段堆积的峰高

3 使用covplot可视化BED数据

一般拿到数据后，会先可视化一下数据的全景

# 自带示例数据（这也是Bioconductor包的一个特点，提交R包需要有说明书和测试数据）
library(ChIPseeker)
library(ggplot2)

files <- getSampleFiles()
# 有5个文件
> basename(unlist(files))
[1] "GSM1174480_ARmo_0M_peaks.bed.gz"                   
[2] "GSM1174481_ARmo_1nM_peaks.bed.gz"                  
[3] "GSM1174482_ARmo_100nM_peaks.bed.gz"                
[4] "GSM1295076_CBX6_BF_ChipSeq_mergedReps_peaks.bed.gz"
[5] "GSM1295077_CBX7_BF_ChipSeq_mergedReps_peaks.bed.gz"

covplot(files[[5]])

还支持多个文件同时画

只要转为GRanges对象即可

# 比如要画第4、5个文件（MACS生成的BED文件包含常规的5列）
peak=GenomicRanges::GRangesList(CBX6=readPeakFile(files[[4]]),CBX7=readPeakFile(files[[5]]))

画图

covplot(peak, weightCol="V5") + facet_grid(chr ~ .id)

取小区间，例如只取几条染色体，还能定义染色体的区间大学

covplot(peak, weightCol="V5", chrs=c("chr17", "chr18"), 
        xlim=c(4e7, 5e7)) + facet_grid(chr ~ .id)

在看完数据全景之后，就会想知道这些peaks和什么类型的基因有关

4 annotatePeak进行peaks的注释

需要使用BED文件（作为query）+注释文件（作为target）

重点是如何获取注释文件

注释信息一般要包含基因的起始终止，基因的外显子、内含子及它们的起始终止、非编码区域位置、功能元件的位置等

ChIPseeker没有物种限制，但前提是物种本身有这些注释信息（不能说物种连参考基因组也没有，那就真的是巧妇难为无米之炊）

需要一个TxDb对象，例如TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene，然后ChIPseeker就会从中提取信息

# 三步走（提供TxDb注释、提供bed文件、进行注释）
require(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
txdb = TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene
f = getSampleFiles()[[4]]
x = annotatePeak(f, tssRegion=c(-1000, 1000), TxDb=txdb)

看到这里有个参数tssRegion ，它指定了启动子区域（而启动子区域是没有明确定义的，需要自己指定，这里指定了上下游1kb）

看一下大体结果：

> x
Annotated peaks generated by ChIPseeker
1331/1331  peaks were annotated
Genomic Annotation Summary:
             Feature  Frequency
9           Promoter 48.1592787
4             5' UTR  0.7513148
3             3' UTR  4.2073629
1           1st Exon  0.7513148
7         Other Exon  3.9068370
2         1st Intron  6.5364388
8       Other Intron  4.8835462
6 Downstream (<=300)  1.1269722
5  Distal Intergenic 29.6769346

看一下详细结果：

as.GRanges(x) %>% head(3)

可以转为数据框，方便输出：

tmp=as.data.frame(x)

关于注释的类型：

注释类型一：genomic annotation（annotation这一列）

指peak在基因组的位置：落在什么地方，例如外显子、内含子或是UTR

注释类型二：nearest gene annotation（annotation后面的列）

指peak最近的基因：不管peak落在内含子、基因间区还是其他位置，按照peak相对于转录起始位点的距离，都能找到一个离它最近的基因【一般做基因表达调控的，会关注promoter区域，离结合位点最近的基因更可能被调控】

这个距离是根据转录起始位点来计算，一个基因具有多个转录本，因此一个基因可能有多个转录起始位点。注释的结果就会看到有一列是转录本ID

注释类型三：flankDistance（三列: flank_txIds, flank_geneIds和flank_gene_distances）

指peak上下游某个范围内（比如-5kb《=》5kb范围内）都有什么基因

# 传个参数flankDistance
x2 = annotatePeak(f, tssRegion=c(-1000, 1000), TxDb=txdb, addFlankGeneInfo=TRUE, flankDistance=5000)

让基因名变得友好

上面得到的结果都是以geneId（Entrez ID）给出，如果想要Symbol名称，可以再传参数annoDb

library(org.Hs.eg.db)
x3 = annotatePeak(f, tssRegion=c(-1000, 1000), TxDb=txdb, 
                  addFlankGeneInfo=TRUE, flankDistance=5000,
                  annoDb = "org.Hs.eg.db")
tmp3=as.data.frame(x3)

会再增加3列：ENSEMBL、SYMBOL、GENENAME（如果这里使用的TxDb是Ensemble ID，那么结果就会是Entrez ID、SYMBOL、GENENAME三列）

按正负链分开注释

一般ChIPseq数据通常情况下是没有正负链信息的（有特殊的实验可以有）

但如果要做，可以先给peaks分别赋予正负链的信息，然后指定参数sameStrand=TRUE 并分别做两次

这个参数的意思是：（logical）whether find nearest/overlap gene in the same strand

只注释基因的上游或下游

提供了ignoreDownstream和 ignoreUpstream，默认是FALSE

关于TxDb的知识

上面一起操作的前提是物种本身有这些注释信息，而注释信息主要是用TxDb

同一物种的不同版本TxDb

例如TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene和TxDb.Hsapiens.UCSC.hg38.knownGene 的注释结果是不同的，不能混用。用哪个取决于上游分析比对使用的哪个版本的基因组

不同的版本中基因坐标是不一样的，如果硬要替换，可以使用liftOver将基因组版本坐标进行转换

支持多少物种？

Bioconductor上有30个左右TxDb，也只能覆盖一小部分物种（https://bioconductor.org/packages/3.11/data/annotation/），但UCSC和Ensemble的基因组都可以被ChIPseeker支持，因此所有物种都支持

除了基因注释还能注释lincRNA

比如就可以利用：https://bioconductor.org/packages/3.11/data/annotation/html/TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.lincRNAsTranscripts.html

require("TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.lincRNAsTranscripts")
linc_txdb=TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.lincRNAsTranscripts
x=annotatePeak(peak, TxDb=linc_txdb)
as.GRanges(x)

如何自己制作TxDb？

使用GenomicFeatures包来制作TxDb对象

• makeTxDbFromUCSC： 通过UCSC在线制作TxDb
• makeTxDbFromBiomart: 通过ensembl在线制作TxDb
• makeTxDbFromGRanges：通过GRanges对象制作TxDb
• makeTxDbFromGFF：通过解析GFF文件制作TxDb

比如在线从UCSC生成TxDb：

require(GenomicFeatures)
# makeTxDbFromUCSC()函数依赖RMariaDB这个包
# BiocManager::install('RMariaDB')
hg19.refseq.db <- makeTxDbFromUCSC(genome="hg19", table="refGene")
# 可能会遇到一个报错：namespace ‘DBI’ 1.0.0 is already loaded, but >= 1.1.0 is required =>自己升级
# remove.packages("DBI", lib="~/Library/R/3.6/library")
# packageurl <- "https://cran.r-project.org/src/contrib/DBI_1.1.0.tar.gz"
# install.packages(packageurl, repos=NULL, type="source")

然后可以对比一下：

再比如自己下载GTF然后生成TxDb
以大豆（glycine_max）为例

# 下载
download.file('ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-47/gff3/glycine_max/Glycine_max.Glycine_max_v2.1.47.chr.gff3.gz',destfile = 'Glycine_max_v2.1.47.chr.gff3.gz')
# 解压
R.utils::gunzip('Glycine_max_v2.1.47.chr.gff3.gz')
# 制作
glycine <- makeTxDbFromGFF("Glycine_max_v2.1.47.chr.gff3")

有了TxDb怎么查看呢？

最详细的操作在官方文档：https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/GenomicFeatures/inst/doc/GenomicFeatures.pdf

不管是从Bioconductor下载的还是自己制作的，都是一个GenomicFeatures对象

如果简单对名称操作，会返回这个注释文件的基本信息。要把TxDb当成一个数据库来对待，而不是一个简单的数据框或者矩阵。因此它的提取方法也会比较特别

• 如果想看其中包含的类目，可以用columns(txdb)

• 如果想指定提取转录本或外显子信息，可以：transcripts(txdb) 或者 exons(txdb)

• 如果想看全部的信息，可以：AnnotationDbi::select(glycine, columns=columns(glycine), keys=keys(glycine), keytype=c("GENEID"))

需要注意，如果使用这个select的时候，同时加载了tidyverse，那么同名的select就会发生冲突导致报错，这时可以用显式指定的形式来规范（如下图）

可视化

peak在整个染色体的分布

见：第3部分=》 使用covplot可视化BED数据

peak在某个窗口的结合谱图

一般有两种方式：一是直接使用BED文件，二是一步步手动进行

第一种：直接使用BED文件

peakHeatmap(f, weightCol="V5", TxDb=txdb, 
            upstream=3000, downstream=3000, 
            color=rainbow(length(f)))

其实看运行日志也能看出来做了什么，首先根据转录起始位点指定上下游（也就是热图的窗口区间范围），然后把peaks比对到这个窗口，并生成矩阵以进行可视化

稍微查看一下这个peakHeatmap函数，就会发现以上说的几步：

当然，如果是多个文件也是可以的

files=getSampleFiles()
peakHeatmap(files, TxDb=txdb, 
            upstream=3000, downstream=3000, 
            color=rainbow(length(files)))

第二种：一步步手动进行

如果说第一种提供了一个打包好的计算过程，那么第二种就是把第一种拆分运行

promoter <- getPromoters(TxDb=txdb, 
                  upstream=3000, downstream=3000)
tagMatrix <- getTagMatrix(f, 
                          windows=promoter)
tagHeatmap(tagMatrix, xlim=c(-3000, 3000), 
           color="red")

看看结合的强度

第一种：直接使用BED文件

plotAvgProf2(files[[4]], TxDb=txdb, 
             upstream=3000, downstream=3000,
             xlab="Genomic Region (5'->3')", 
             ylab = "Read Count Frequency",
             conf = 0.95, resample = 1000)# 添加置信区间

第二种：手动进行

使用上面的tagMatrix计算结果

plotAvgProf(tagMatrix, xlim=c(-3000, 3000),
            xlab="Genomic Region (5'->3')", 
            ylab = "Read Count Frequency")

支持多个数据比较

tagMatrixList <- lapply(files, getTagMatrix, 
                        windows=promoter)
# 添加置信区间并分面
plotAvgProf(tagMatrixList, xlim=c(-3000, 3000), 
            conf=0.95,resample=500, facet="row")

这个结果和上面peakHeatmap的结果一致，前3个样本不是调控转录的

除了关注转录起始位点（研究转录调控），还能看蛋白与外显子/内含子起始位置的结合谱，使用getBioRegion函数，可以指定'gene', 'transcript', 'exon', 'intron'

注释结果之注释类型一：genomic annotation

指peak在基因组的位置：落在什么地方，例如外显子、内含子或是5’ /3‘UTR

饼图

peakAnno <- annotatePeak(files[[4]], 
                         tssRegion=c(-3000, 3000),
                         TxDb=txdb, annoDb="org.Hs.eg.db")
plotAnnoPie(peakAnno)

柱状图

plotAnnoBar(peakAnno)

注意第一个问题：关于上图中的各种Features分类

看到这里的分类有下游（Downstream）但没有上游，这是因为Promoter定义为了转录起始位点（TSS）的上下游区域，包含了上游；另外这个下游是是基因间区的一部分，更确切是指紧接着基因的下游；这里的上游和下游其实都是基因间区，单独拿出来是因为和基因直接连接，是很近的区域=》近端基因间区

当然，基因间区还包含更远的间区（Distal intergenic）=》远端基因间区

默认下游的范围是3kb，但是可以自己调整

# 比如调成500
options(ChIPseeker.downstreamDistance = 500)

还有一个需求就是：自定义分类

# 依然是设置options，用于总结结果
f2=getSampleFiles()[[5]]
options(ChIPseeker.ignore_1st_exon = T)
options(ChIPseeker.ignore_1st_intron = T)
options(ChIPseeker.ignore_downstream = T)
options(ChIPseeker.ignore_promoter_subcategory = T)
x=annotatePeak(f2)
plotAnnoPie(x)

注意第二个问题：peak的位置可能不是唯一的

这是因为，一个peak所在的位置，可能是一个基因的外显子，同时又是另一个基因的内含子。为了解决这个问题，有以下几种方案：

• 第一种：使用参数genomicAnnotationPriority指定优先顺序

默认顺序是：Promoter => 5’ UTR => 3’ UTR => Exon => Intron => Downstream => Distal Intergenic

• 第二种：饼图+韦恩图

vennpie(peakAnno)

优点是：直观；缺点是：无法显示全部的信息

• 第三种：UpSetR + vennpie

upsetplot(peakAnno, vennpie=TRUE)

多个文件的区域注释

peakAnnoList <- lapply(files, annotatePeak, 
                       TxDb=txdb,tssRegion=c(-3000, 3000))
plotAnnoBar(peakAnnoList)

注释结果之注释类型二：nearest gene annotation

指peak最近的基因：不管peak落在内含子、基因间区还是其他位置，按照peak相对于转录起始位点的距离，都能找到一个离它最近的基因

plotDistToTSS(peakAnno,
    title="Distribution of transcription factor-binding loci\nrelative to TSS")

同样也支持多个文件

plotDistToTSS(peakAnnoList)

距离最近的基因在不同样本的交集

# 先得到基因列表
genes <- lapply(peakAnnoList, function(i) 
    as.data.frame(i)$geneId)
> names(genes)
[1] "ARmo_0M"    "ARmo_1nM"   "ARmo_100nM" "CBX6_BF"    "CBX7_BF"  
                
# 然后作图(需要借助Vennerable包)
devtools::install_github("js229/Vennerable")
library(Vennerable)
vennplot(genes[2:4], by='Vennerable')

基因注释 + 富集分析

利用ChIPseeker的seq2gene 将peak的位置与所有的基因关联起来【包括 host gene (exon/intron), promoter region and flanking gene from intergenomic region】，然后用clusterProfiler拿这些基因跑ORA，做富集

require(clusterProfiler)
bedfile=getSampleFiles()
# 将bed文件读入（readPeakFile是利用read.delim读取，然后转为GRanges对象）
seq=lapply(bedfile, readPeakFile)

genes=lapply(seq, function(i) 
    seq2gene(i, c(-1000, 3000), 3000, TxDb=txdb))
cc = compareCluster(geneClusters = genes, 
                    fun="enrichKEGG", organism="hsa")
dotplot(cc, showCategory=10)

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