2019-07-25

如何估计宏基因组样本中的物种组成及丰度？
答：宏基因组中的物种分类，一般用OTU (operational taxonomic unit), 即可操作物种单元，来表示。在典型情况下，原核生物的OTU使用16S rDNA来衡量，真核生物的OUT使用18s rDNA来衡量。
但选择16S/18S rDNA鉴定物种，存在以下几个问题：

1）rDNA之间的平行转移来干扰rDNA鉴定的可靠性。

2）在单个细菌中，16r DNA可能存在序列不同的几个拷贝，干扰估计OTU数目的准确性。

所以，其他备选的标记基因，比如单拷贝的看家基因被推荐用来作为菌种鉴定的标记。

如何衡量样本中物种的多样性？
答： 为了估算测序的物种的比例，通常用rarefaction curse来表示。
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宏基因组如何做De Novo拼接？
答：由于宏基因组测序的覆盖率通常是不完全的，所以组装所需要的序列并不是很完整。并且组装的时候，可能会把来自不同分类单元（OTU）的序列组装在一起，产生嵌合体基因组。Phrap,Forge,Arachne,JAZZ和Celera Assembler等可用来组装由sanger法产生的宏基因组序列。这些算法大部分都利用mate-pair信息来参与组装。这些算法用顶点来代表每条read,互相重叠的read之间用边连起来，它们的组装问题可以转换成“哈密尔顿路径”搜索问题，即找到一条路径走过所有顶点，且每个顶点只走一次。

如何进行菌群间差异分析？

答：有几种基于序列特征的比较，包括样品间GC含量的比较，微生物基因组大小的比较，系统发育关系树的比较和功能组分的比较。许多比较分析都用到了关联统计学的方法，通常假设有几种元数据影响观测到的宏基因组群体的组分。主成分分析（PCA）和非度量多维标度（NM-MDS）用来图形化展示数据并揭示有哪些因素最影响数据。
有几种进行宏基因组比较分析的软件。第一个是MEGAN，可以比较两个或几个标准化后的样品的GC含量。第二种是MG-RAST，提供了一种比较功能和基于序列的分析来上传样本。第三种是CAMERA，提供了BLAST接口让客户可以比对40多种现有的宏基因组数据。

如何预测编码基因？
答：目前发现编码基因的方法有两种。一种是基于BLAST比对的方法，这种方法通过比对已有的数据库，可以发现宏基因组数据中有哪些已知基因的同源基因的存在，但缺陷是找不到哪些和已经基因没有同源关系的新基因。第二方法是重新预测基因的方法，这些方法大部分是基于有指导学习和统计模式识别的方法，包括隐马尔科夫模型。GeneMark.hmm就是基于单密码子频率的非均一马尔科夫模型来预测基因的软件，当这些软件用到宏基因组数据上时，这些软件通常无法确定部分的ORF,即使这些 ORF是真实基因的一部分。

如何进行代谢通路分析（pathway analysis）?
答: 代谢通路分析是为了研究某一个环境中各种代谢途径的富集程度。一般需要根据统计检验方法（如P-value）来筛选。常用的代谢通路数据库有KEGG、Reactome、BioCyc、RegulonDB、 WikiPathwans等。
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系统分析基因功能、基因组信息数据库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。基因组信息存储在GENES数据库中，包括完整和部分测序的基因组序列；更高级的功能信息存储在Pathway数据库里，包括图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信号传递、细胞周期，还包括同系保守的子通路等信息。KEGG的另一个数据库是LIGAND，包括关于化学物质、酶分子、酶反应等信息，可以免费获取。KEGG提供的整合代谢途径 （Pathway）查询十分出色，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代谢及有机物的生物降解，不仅提供了所有可能的代谢途径，而且对催化各步反应的酶进行了全面的注解，包含有氨基酸序列、PDB的链接等。