免疫三千问—单细胞测序之肿瘤微环境

以抗PD-1药物为代表的肿瘤免疫疗法快速发展，让人们看到了战胜癌症的希望。免疫治疗的先驱者陈列平教授提出的“免疫正常化”研究思路，认为肿瘤微环境的复杂性和多样性与免疫治疗疗效密切相关。尤其是肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）的相互协同作用，是抗癌反应的关键点。以往免疫微环境研究只能从免疫细胞“整体”表征下手，而无法突破单个免疫细胞“个体”表征。现在10x Genomics单细胞V(D)J测序技术在肿瘤免疫微环境中的应用，解决了单个免疫细胞“个体”表征无法突破的难题，精准的刻画每个细胞的基因信息[1]。

10x 单细胞V(D)J测序的前世今生

2009年单细胞测序技术的横空问世完美的刻画了每个细胞独特的微妙变化，揭示全新的细胞类型；到2015年10x Genomics单细胞测序技术的出现，彻底降低了单细胞测序的成本；尤其是2018年10x Genomics单细胞V(D)J测序技术的上市，为肿瘤免疫治疗的研究打开了全新纪元。相应成果也备受CNS青睐，文章如雨后春笋般频频出现在高分杂志中，据统计近两年的重量级高分文章发表篇数60+，平均影响因子达到20（IF：20）。

10x 单细胞V(D)J测序技术大显身手

小贝已给大家讲述了10x单细胞V(D)J测序技术的由来，那么该技术究竟可以解决那些问题呢？ 想来是大家特别关注的问题~

a 肿瘤微环境与免疫治疗

b 自身免疫性疾病的治疗

c 器官、骨髓移植的治疗

d 抗体开发的哒哒哒哒哒

e 感染性疾病哒哒哒哒哒

10x 单细胞V(D)J测序技术在肿瘤微环境中的用武之地

10x单细胞V(D)J测序技术可以为肿瘤微环境的研究提供哪些的信息呢？小贝将逐一为大家解析。

1 免疫细胞图谱构建

通过5’表达和V(D)J数据进行联合分析，基于基因表达分群的基础上，可分析克隆信息鉴别新的细胞亚群。2018年cell发表的肺癌浸润性免疫细胞研究中，通过t-SNE降维、聚类分析，将来源于癌、癌旁和外周血中的9,055个T细胞分为7个CD8+T细胞亚群和9个CD4+T细胞亚群。并按照相关的marker基因，将这些cluster进行注释，精准刻画了肺癌T细胞的免疫图谱。

图1. T细胞亚群免疫特征（图片引自原文[2]）

2 免疫细胞克隆型及丰度研究

在肿瘤微环境的研究中，对样本Clonotype分型分析和丰度分析，可以追踪TCR克隆型和转录表型，从而揭示肿瘤识别、克隆扩增和T细胞功能的关联。2019年Cell发表的一篇黑色素瘤浸润性免疫细胞研究中，使用MARS-seq进行TCR测序，从6,306个T细胞中恢复TCRβ序列信息，其中包括3,492个独特的TCRβ序列，并使用“MetaCell”方法计算克隆丰度。从而进一步分析细胞间克隆型及丰度关系。

图2. 黑色素瘤T细胞TCR克隆型分析（图片引自原文[3]）

3 TCR-CDR3特征研究

在T细胞对肿瘤抗原的识别中，CDR3是TCR测序优先选择的研究目标区域，TCR-CDR3区的特征（CDR3区的长度、序列等）研究可直接反映出T细胞多态性和克隆化程度，从而反映T细胞的功能及肿瘤免疫应答状态。2018年Cell发表的一篇肿瘤免疫微环境研究中，对1,744个T细胞的V(D)J区域富集，86％具有至少一个生产性的全长TCR α或β链，大多数T细胞含有独特的TCR，并且通过TCR-CDR3区域分析，从而证明FT和PDO中表现最高的TCR克隆型在耗尽的T细胞中相同地集中。

图3. T细胞TCR-CDR3特征分析（图片引自原文[4]）

4 细胞亚群发育轨迹研究

已有的T细胞研究表明，T细胞亚群之间各自独立成簇，但彼此之间无明显界限，可能存在一定的连续性，说明不同细胞亚群间可能有潜在的发育关系。因此对Cluster的细胞分群进行拟时序分析，可以构建亚群间的发展轨迹。2018年Cell发表的一篇非小细胞肺癌T细胞图谱研究中，对不同簇的CD8 +T细胞进行拟时序分析，通过Monocle方法推断CD8+T细胞分支轨迹，共享的TCRs推断CD8 + T细胞群的状态转移。对CD8+ T细胞进行了拟时序分析，构建了亚群间潜在的发展轨迹，这一结果也通过亚群间TCR克隆分析得到验证。

图4. 拟时序分析（图片引自原文[2]）

5 多样本TCR差异研究

多样本TCR研究可将同一患者治疗前后或不同患者间的样本进行免疫组库数据对比分析，得到样本间免疫组库多样性的差异，可分析疾病发生时及药物治疗前后机体免疫组库多样性的变化，有利于进一步解析疾病发生发展的原因[5]。2019年Nature Medicine发表的一篇基底细胞癌免疫治疗前后肿瘤浸润T细胞的研究，基于TCR-seq数据分析，PD-1治疗后出现大量新型的克隆扩增，与所有其他CD8 +T细胞表型相比，耗竭CD8 +T细胞在治疗后显著扩增的克隆比例更高，并且观察到耗竭CD8 +T细胞克隆的克隆替换。

图5. 多样本TCR分析（图片引自原文[6]）

总  结

10x Genomics单细胞V(D)J测序有三好

超高性价比：同时测量来自相同单细胞配对的TCR α/β和BCR重链/轻链信息和基因表达，精准TCR/BCR结构信息。

更直观：使用直观的软件工具展示免疫组库的克隆性，多样性和细胞环境，对于分析软件工具可视化。

更全面：分析数百至数万个淋巴细胞，以检测罕见的全长V(D)J转录本和细胞亚群。

参考文献

1. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment [J].Cell, 2018.

2. Guo X , Zhang Y , Zheng L , et al. Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing[J]. Nature medicine, 2018, 24(7).

3. Dysfunctional CD8 T Cells Form a Proliferative, Dynamically Regulated Compartment within Human Melanoma [J].Cell 2019, 176(4):775-789.

4. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment[J].Cell, 2018.11.021.

5. Jiao S , Subudhi S K , Aparicio A , et al. Differences in Tumor Microenvironment Dictate T Helper Lineage Polarization and Response to Immune Checkpoint Therapy[J]. Cell, 2019, 179 (5):1177-1190.e13.

6. Yost K E , Satpathy A T , Wells D K , et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade[J]. Nature medicine, 2019, 25(7735).

7. Zhang A W, O'Flanagan C , Chavez E A , et al. Probabilistic cell-type assignment of single -cell RNA-seq for tumor microenvironment profiling[J]. Nature Methods, 2019, 16 (10):1-9.