2021-02-21--文献阅读--人食管鳞癌微环境中的免疫抑制
Immune suppressive landscape in the humanesophageal squamous cell carcinomamicroenvironment--Nature communications--12.121
思路：
单细胞测序分析CD45+的细胞（免疫细胞）→利用经典标记对免疫细胞注释，研究免疫细胞的成分差异→阐明免疫细胞改变的分子机制→研究免疫细胞TCR序列的变化，克隆性，说明起源问题→研究髓系细胞，TAMs（肿瘤相关巨噬细胞），WCGNA研究细胞分子特征→细胞间相互作用（scTHI）
一、摘要
我们获得了一个详细的单细胞分辨率的食管鳞状细胞癌（ESCC）免疫细胞图谱。阐述了哪些免疫细胞处于休眠状态，哪些免疫细胞处于增值状态，以及这些细胞与免疫抑制之间的关系。
二、介绍
①食管癌在组织学上可分为两个亚型：腺癌（EAC）和鳞状细胞癌（ESCC）。食管鳞癌是食管癌的主要亚型，约占全世界食管癌的90%
②最近，PD-1抗体用于晚期食管癌一线化疗失败的患者显示，与化疗相比，总体生存率只有中度的改善。
③我们用高维（high-dimensional）scRNA序列分析了从七个切除的食管鳞癌肿瘤及其邻近组织中分离的总免疫细胞。同时进行T细胞受体（TCR）测序，以获得T细胞克隆性的信息
④相较于癌旁正常组织，肿瘤组织T细胞明显扩增。
⑤我们在这些肿瘤中发现了耗尽的T细胞、耗尽的NK细胞、调节性T（Treg）细胞、交替激活的巨噬细胞（M2）和耐受性树突状细胞（tDCs），表明ESCC中存在炎症但免疫抑制的TME。
⑥我们鉴定出了一个与预后相关的基因集
三、结果
1、ESCC免疫细胞的scRNA序列
①我们分析了从7对新鲜、手术切除的肿瘤和ESCC邻近组织中分离出CD45+细胞进行单细胞测序。过滤后，共80787个细胞（每个样品3248-9078），中位基因数1170个。
②我们将所有样本的单细胞数据进行标准化和汇总，并进行无监督聚类以识别可区分的群体，用的是Seuratv3.0
③我们利用典型标记对这些细胞进行了注释；这些细胞类型的经典标记物的表达与注释一致
④我们发现肿瘤中的t细胞和单核/巨噬细胞增多。与此相反，B细胞和NK细胞的百分率降低
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⑤我们发现肿瘤的免疫成分有很大程度的变异
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⑥T细胞是大多数肿瘤中最丰富的免疫细胞类型，占CD45+细胞总数的30-71%
⑦根据流式细胞仪所得Tcell所占比例，七对样本大致分为两组：
（S133、S134和S150）--在这些肿瘤中，T细胞所占的比例不到总细胞的2%。
（S135、S149、S158、S159）--这些肿瘤中，免疫谱在PCA中呈现显著变化，其中6–12%的细胞是T细胞。
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⑧基因特征富集分析：发现患者间的生物学特征存在差异
⑨通过流式细胞术和免疫组化验证细胞类型的分析结果；主要细胞结果一致；免疫组化检测到了部分中性粒细胞，而scRNA-seq未能检测到中性粒细胞，这可能是由于ESCC中性粒细胞丰度低和目前10×scRNA-seq技术的局限性所致。
我们发现ESCC是浸润性T细胞和单核/巨噬细胞数量较多，浸润性B细胞数量较少的肿瘤类型之一
⑩最近的研究表明肿瘤浸润的B细胞，特别是三级淋巴结构中的B细胞，对免疫治疗的反应增强有积极作用
2、T细胞和NK细胞的聚类及亚型分析
①T细胞和NK细胞是TME中主要的细胞毒性免疫细胞，我们对来自所有样本的T细胞和NK细胞进行无监督聚类，我们鉴定了6个CD4 T细胞簇，7个CD8 T细胞簇，1个CD4和CD8双阴性T细胞簇和3个NK细胞簇
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②在T细胞中，我们使用已知的功能性标记来提示CD4 T细胞群，包括天真、记忆、效应、耗尽的T细胞和Tregs。这些标记物还鉴定了CD8T细胞群，包括记忆、效应、细胞毒性和耗尽的T细胞。
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③我们使用了公众的navie，Treg，exhuastion和cytotoxic signature，应用到我们的CD8、CD4分类细胞，并计算出转录信号得分。未发现幼稚的CD8 T细胞簇。提示食管鳞癌浸润的CD8T细胞大多处于活动、记忆或衰竭状态
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④我们进一步分析了与GFBP2、LAG3和FOXP37表达高度相关的基因。前50个基因用于细胞毒性、衰竭和Treg的分配。然后我们使用这些特征分析T细胞簇，发现富集分数与公布的特征一致。
⑤CD4群体中存在着谱系联系，exhaustion和Treg评分的可视化证实了这两个簇之间的重叠
⑥细胞毒性和耗尽的CD8 T细胞都表达许多效应分子，如GnY和GZMH，而耗尽的DCD8 T细胞表达的IFNG水平高于细胞毒性细胞（图2f），这表明耗尽的T细胞仍表达高水平的某些效应分子并试图对肿瘤细胞作出反应；
这些结果提示CD8-C5-CCL5处于衰竭早期，CD8-C7-TIGIT处于衰竭期，CD8-C6-STMN1可能是CD8-C5-CCL5与CD8-C7-TIGIT的过渡期。
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⑦有报道称大量浸润肿瘤的CD8T细胞是识别与癌症无关的表型的旁观者。这些细胞缺乏CD39，在表型上不同于肿瘤抗原特异性CD8T细胞，然后我们分析了CD39在CD8 T细胞中的表达
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3、肿瘤中T细胞和NK细胞状态的改变
①我们比较了肿瘤和邻近组织中的T细胞簇。CD45+细胞中的 （Treg cluster CD4-C6-FOXP3） and （exhausted CD4 T cells CD4-C5-STMN1 ）的百分比与匹配的邻近组织相比显著增加；
流式细胞术也证实了在ESCC肿瘤中Tregs的富集。
同样，耗尽的cd8t细胞在肿瘤中富集。
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②在ESCC中，PD1在CD8 T细胞中的表达一直较高（图3f）。肿瘤组织中Tregs和耗尽的DCD4和CD8 T细胞显著增加表明存在免疫抑制环境
③我们还观察到，与匹配的邻近组织相比，肿瘤组织中的NK细胞显著减少；
NK-C1-NCR3表达高水平的NCR3、CD266、NKG7和LAMP1（图3h）。
相反，NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1簇高水平表达KLRC1和ITGA1抑制性受体（图3h）。
流式细胞术分析证实，与邻近组织相比，ESCC中NKG2A（KLRC1）在NK细胞中的表达增加（图3i）。事实上，NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1的细胞毒性分数极低；相反，衰竭分数升高（图3j），这表明在ESCC中NK细胞不足，功能受损
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④我们对先前显示的G1/S或G2/M期的细胞周期基因进行了增殖评分，来推断T和NK细胞簇的增殖状态。我们发现富含耗竭基因的CD4-C5-STMN1、CD8-C6-STMN1和NK-C2-STMN1都具有高度增殖性（图3k-m），这与最近的研究一致，即耗竭的T细胞是肿瘤内主要的增殖免疫细胞室。
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4、CD4和cd8T细胞的克隆性。
①根据TCR结果我们共观察到15654个独特的tcr序列。观察到克隆扩展，克隆大小从2到2600（图4a）。
如预期的那样，患者之间没有发现共享克隆。与其他癌症类型的研究一致，大多数TCR是独特的。然而，TCR基因型的组成在患者中是高度可变的
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②S149和S150肿瘤中有65%和68%的T细胞具有两个以上细胞共用的TCR，这表明这些肿瘤中T细胞的高度克隆性扩增（图4b）。与匹配的邻近组织相比，7名患者的肿瘤中有4人的扩增克隆数增加。
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④CD8 T细胞的克隆性细胞明显多于CD4 T细胞，并且幼稚的CD4-C1-CCR7簇显示出非常有限的克隆性扩增（图4d）。
⑤CD8-C1-NKG7是CD8 T细胞中的细胞毒性簇，在邻近组织中具有较高的频率，在邻近组织中也显示出比肿瘤组织中更高的克隆扩增（图4e）。
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⑥然而，与邻近组织相比，肿瘤中的Tregs克隆数增加（图4f），这表明特异性克隆细胞的扩张可能是肿瘤中Tregs高百分比的原因。
⑦我们在CD4细胞的所有簇（包括Tregs）和CD8细胞的所有簇（C2除外）中发现了TCR序列的共享（图4g，h）
⑧CD8-C7-TIGIT与CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1共有的克隆数分别为166（9.0%）和156（8.4%）（图4i）。
⑨Treg簇CD4-C6-FOXP3在肿瘤中也有相同的趋势，与CD4-C1-CCR7共有的克隆型占14.4%，在邻近组织中占40.7%（图4j和补充图8c）
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⑩这暗示了一些树突状细胞和幼稚的CD4 T细胞的潜在共同起源。我们之前的研究表明不同簇的T细胞不是完全独立的，但可能经历广泛的状态转变。
5、ESCC中髓样细胞的不同功能成分
5.1tumor-associated macrophages (TAMs)--肿瘤相关巨噬细胞
①接下来，我们对髓系细胞进行无监督聚类。十四个簇被鉴定，包括9簇单细胞/巨噬细胞和5簇树突状细胞（图5a）。
②利用已发表的信号特征：单核细胞（Mono）、经典活化巨噬细胞（M1）、交替活化巨噬细胞（M2）和髓源性抑制细胞（MDSCs）；
③我们使用Monocle，一种无监督的推断方法，来构建细胞转化的潜在发展轨迹。另一种算法Slingshot的结果（s9b）；
巨噬细胞中M1和M2信号之间的显著相关性（补充图。9c），表明ESCC中存在一个复杂的巨噬细胞极化过程，这与其他研究一致
Mono-C1-VCAN显示出强大的单核细胞信号（图5b）。
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④我们用wgcna对单核/巨噬细胞进行加权相关网络分析
我们发现绿松石模块与单核细胞簇、单核细胞C1-VCAN和单核细胞C2-IL1B正相关，与M2簇宏C3-CSF1和MDSC簇MDSC-C1-C1QC、MDSC-C2-APOE负相关（图5d，e）;我们进一步分析了这个模块中的基因以及它们与Mono-C1-VCAN的关联（图5f），以选择最相关的前50个基因，形成一个特征集；
有趣的是，这一特征与ESCC（图5g）以及宫颈鳞状细胞癌和肺鳞状细胞癌（补充图9g）的高无进展生存率密切相关，这表明这一特征可作为ESCC和其他组织鳞状细胞癌的预后生物标志物。
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⑤我们进一步应用单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）方法探索可能调控单核细胞、M1和M2的转录因子（图5h）；除了S158，其它肿瘤对比正常组织表现出明显的高低表达差异。
⑥转录因子BHLHE40在M2中特异表达。我们进行了网络分析以确定BHLHE40下游基因，并通过Metascape分析其功能（图5j）。数据显示bhlhe40下游基因与髓系细胞分化相关，并负调控细胞反应
⑦我们的数据表明，ESCC微环境中抑制性TAM的富集可能有助于疾病的进展，他们阐明了一些与预后相关的令人信服的候选TF
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5.2
①五个DC簇表达热图（图6a）;DC-C3-LAMP3癌旁组织中富集（图6b）。
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②发现LAMP3+DC与其他树突状细胞亚群相比具有更高的活性和迁移能力，同时其还富集到了耐受性特征（图6c）
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③AMP3+dc表达许多调控分子，如IDO1、EBI3、CD274和IL10（图6d）；AMP3+DC在细胞因子介导的信号转导、DC细胞分化、白细胞活化、膜转运、抗基因处理和表达途径中富集（s10a），支持此DC子集为多功能
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④流式显示：LAMP3+DC表达的CD83、CCR7和PDL1明显高于LAMP3 DC（图6e，f）、提示LAMP3+DCs的成熟、迁移和调控能力。
⑤多色ihc染色也证实了肿瘤组织中CD11C+LAMP3+PDL1+IDO+DCs的存在（图6g）。
⑥我们进一步用IFNγ和LPS治疗dc。有趣的是，我们发现IFNγ和lps刺激诱导dc表达PDL1和IDO（图6h）；
当DCs与CD4+CD45RA+幼稚T细胞共培养时，诱导FOXP3表达的能力增强（图6i）。
提示IFNγ和LPS可能在体外诱导耐受性DCs
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⑦此外，景观分析显示，不同的转录因子组可以区分DCS亚群（图6j），然后作者研究了这些转录因子中报道过的一些，用Metascape分析网络，找下游。
6、ESCC中免疫细胞间的细胞-细胞相互作用。
①我们基于已知配体-受体对在任何两种肿瘤浸润性免疫细胞中的共同表达，对潜在的细胞-细胞相互作用进行了系统分析
scTHI--另一种广泛使用的方法--分析巨噬细胞和Tregs的相互作用
②我们发现巨噬细胞和Tregs之间TNF-TNFSF1B、CCL4-CCR8和IL-1β-IL1R2的相互作用具有较高的相互作用得分，并且Tregs在肿瘤中表达高水平的TNFSF1B、CCR8和IL1R2（图7a–c）
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③肿瘤中分离的树突状细胞中IL1R2的表达高于癌旁组织，多色IHC也证实了IL1R2在Tregs中的表达。（图7d）
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④体外共培养和抗体阻断试验表明，Tregs 需要IL1R2才能抑制效应T细胞的IL-1β依赖性，如增殖和IFNγ表达（图7e，f）
⑤我们还预测了Tregs中MHC和巨噬细胞中LILRB1之间的相互作用（图7g）。
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⑥MHC受体LILRB1是髓细胞活化的负性调节因子和M2抑制状态的启动子。MHC–LILRB1相互作用抑制巨噬细胞，是癌症免疫治疗的靶点
通过scrna-seq分析巨噬细胞中LILRB1的表达，并通过FACS进一步验证。我们发现，与邻近组织相比，ESCC中巨噬细胞中LILRB1的表达增加（图7h，i和补充图7）。
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⑦Tregs表达高水平的HLA-A、HLA-B和HLA-C（补充图11e、f）。多色IHC染色也显示ILRB1表达巨噬细胞和Tregs之间存在潜在的物理相互作用（共定位）（图7j）
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⑧当Tregs与巨噬细胞共培养时，我们发现Tregs促进巨噬细胞表达M2标记物，包括CD163和pdl1，并降低TNFα的表达。然而，LILRB1抗体阻断抑制了这些影响（图7k，l和补充图11g，h）
⑨这些数据表明TregS可能通过HLA和LILRB1相互作用调节巨噬细胞的功能，阻断这一途径可能促进ESCC的抗肿瘤免疫
四、讨论
①在这里，我们结合了深链RNA序列和TCR序列，并阐明了整个免疫景观，包括ESCC和邻近组织中固有的和适应性的免疫细胞图谱；描述了ESCC免疫细胞的分类、比例、功能变化及机制、细胞间相互作用
②ESCC富含免疫抑制细胞：Tregs, exhausted CD8 T,CD4 T and NK cells, M2 macrophages, and tDCs；促进免疫逃避和肿瘤进展
③我们证明耗尽的CD4、CD8 T细胞和NK细胞是主要的肿瘤内增殖免疫细胞室，尽管这些细胞富含耗尽基因。
与耗尽簇（CD8-C7-TIGIT）相比，预耗尽簇CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1可能是更好的免疫治疗靶点，因为耗尽簇处于永久性和不易逆转的耗尽阶段，由于其表观遗传变化，使其更耐检查点抑制。
④发现肿瘤浸润的NK细胞不仅在ESCC中普遍减少，而且还表达高水平的检查点分子，包括NKG2A和CD49d，提示处于耗尽状态；据报道，抗NKG2A和抗CD49d是促进抗肿瘤活性的检查点抑制剂
⑤T细胞的TCR序列共享，提示T细胞启动后有着广泛的分化。
⑥衰竭的CD8 T细胞（CD8-C7-TIGIT）与其他CD8簇具有更高比例的共享克隆，尤其是衰竭前簇CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1，这与这些簇的相关状态和多步衰竭假说相一致。
相反，CD8-C1-NKG7是细胞毒性最强的CD8 T细胞簇，在肿瘤中克隆性T细胞明显减少
最近在膀胱癌中也有类似的发现，细胞毒性cd8t细胞（FGFBP2+clusterin）在正常组织中的克隆性比在膀胱癌中的克隆性强。
另一方面，食管细胞毒性细胞的克隆扩增可能是由于食管中的非肿瘤抗原的偶然暴露，并且相邻组织中的大多数CD8-C1-NKG7细胞表达低水平的CD39，这表明它们是旁观者CD8 T细胞。
幼稚的CD8 T细胞可能不常渗入食管或被局部环境激活，因此不太可能被检测为独立的群体。
⑦单核细胞/巨噬细胞在肿瘤中的关键作用已经在肝癌、乳腺癌和肺癌中用scRNA-seq进行了描述；
通常，巨噬细胞的活化分为炎症前M1状态或与炎症溶解相关的M2状态；
我们的分析显示单核细胞/巨噬细胞存在于单核细胞、M1和M2状态的光谱中；M1相关基因和M2相关基因经常在同一细胞中共同表达；M1和M2信号的共存表明TAMs比经典的M1/M2模型更复杂，这种现象在乳腺癌和肝癌中也有发现
当使用WGCNA分析单核/巨噬细胞的基因相关性时，我们发现一组基因与单核细胞呈正相关，在ESCC和其它类似的病理类型肿瘤有着较好的预测预后能力
⑧cDC2特别参与MHCⅡ类介导的抗原提呈和cd4t的活化和扩增细胞.cDC1也是抗肿瘤免疫所必需的。最近，一些文献报道了TME中的DCs，发现大多数与我们的数据一致。
比较了不同癌肿之间的这种差异，对分析出来的细胞做了些功能分析。
⑨我们的工作进一步证实了树突状细胞与巨噬细胞之间的相互作用；
在Treg上表达的IL1R2可能通过阻断IL1β依赖性效应T细胞的活化而增强Treg的功能;
IL1R2在活化的肿瘤树突状细胞上表达，并与肺腺癌的预后不良相关。
我们的研究还表明，Tregs可能通过hhla-A、B、C和LILRB1相互作用调节巨噬细胞的功能。
研究TAMs中这种免疫抑制MHC类I-LILRB1信号轴的机制将有助于开发恢复巨噬细胞功能的疗法。
总之，我们的ESCC和邻近组织免疫细胞的转录图谱提供了一个了解免疫状态的框架，并揭示了ESCC环境中免疫细胞的动态特性。此外，我们还从多个方面阐述了食管鳞癌的免疫抑制状态，这些都是食管鳞癌及其他癌症免疫治疗的潜在新靶点
