千呼万唤始出来-10x Visium 空间转录组文章正式上线

在生命科学的研究进程中，单细胞技术的问世让传统技术如虎添翼，不断地引发生物医学领域的革命热潮。如果说过去的的十年是单细胞技术迅猛发展的黄金期，那么再接下来的十年中，我想大家应该更加关注的是具有黑马趋势的“空间转录组测序技术”。

自2019年10x Genomics 公司在原有的空间转录组（ST）技术基础上推出了创新的 Visium空间转录组测序技术，一经问世，便备受瞩目。该技术将高通量且无偏好的总mRNA分析融入到带有形态背景的完整组织切片上，提供了一个之前难以实现的组织生物学视角。为肿瘤、神经科学、发育生物学的研究开启了一个全新的阶段。该技术在生物医学领域中的应用也已初见苗头，尤其是利用10x Genomics Visium空间转录组联合单细胞转录组测序技术发表在Cell上的《人鳞状细胞癌组织成分和空间结构的多模态分析》文章可以帮助研究者们实现不同单细胞亚群的空间定位，在空间背景下从深入理解组织的发育过程和疾病发生机制。

今天小贝就为大家介绍一下2020年6月23日发表在《Cell》的10x Genomics空间转录组测序的文章，让我们一起来学习大牛们是如何利用空间转录组技术开展科学研究的。

研究背景

皮肤鳞状细胞癌是常见的恶性肿瘤之一，在晚期鳞状细胞癌的治疗中免疫抑制剂Cemiplimab被寄予厚望，但是对预测该药物疗效的生物标记物并不明确，因此探索肿瘤微环境（TEM）内细胞组成和结构对于免疫抑制剂的疗效评估至关重要。该研究将正常组织与肿瘤组织的单细胞和空间转录组数据进行整合，帮助我们了解TME 内细胞通讯的机制。

实验设计

研究方法

1、sc-RNA-seq：10对正常和肿瘤患者的组织；

2、空间转录组（ST）：6个病人肿瘤组织冰冻切片，每个患者2-3张切片；

3、多重粒子束成像（MIBI）：6名患者肿瘤前沿的18个视野（FOVs）；

4、功能验证：异种移植和CRISPR筛选。

研究思路

研究结果

单细胞转录组-发现肿瘤特异性角质细胞（TSK）亚群

» 绘制 cSCC 细胞图谱：利用单细胞转录组测序技术，对肿瘤和正常组织过滤后48,164个细胞降维聚类，获得肿瘤细胞和正常的上皮细胞和基质细胞亚群，构建cSCC细胞图谱。

» 发现肿瘤特异性角质细胞亚群：对正常的上皮细胞重新聚类后，鉴定出3种主要的角质（KC）细胞亚群，在肿瘤组织中聚类鉴别出第四种肿瘤特异性角质细胞群（TSK）。进一步分析表明：（1）TSK标志基因关联分析，提示TSK细胞群具有侵袭性；（2）TSK基因差异表达分析，表达EMT连锁基因的TSK亚群；（3）细胞周期分析，基底细胞（Basal）在肿瘤中的循环周期是正常细胞的约四倍。

图1 肿瘤特异性角质细胞（TSK）亚群[1]

单细胞+空间转录组-揭示肿瘤空间微环境及细胞通讯机制

» 鉴定肿瘤前沿 TSK-Base 异质性：来自scRNA-seq的TSK标记基因的评分Spots突出显示每个患者中一个单一、清晰的高TSK簇。在具有清晰前沿的肿瘤组织中，TSK邻近基质富集了癌症相关成纤维细胞 （CAF）和内皮细胞转录本，表明TSK细胞主要位于纤维血管微环境中。进一步分析发现，80%的TSK簇存在于肿瘤组织的前沿，其余的前沿点富集了Basal肿瘤基因，确定了cSCC肿瘤前沿TSK-Base异质性。

» cSCC 免疫概述：对已知免疫抑制基因表达进行分析发现，CD274（PD-L1）和PDCD1LG2（PD-L2）仅在迁移的树突状细胞中表达且与抑制免疫治疗反应相关。进一步分析得出CD276可增强Tregs并抑制T细胞反应同时在TSK中高表达。并且这些基因在ST中表现出空间簇特异性模式，与特定细胞类型的共区域化一致。在空间位置上，T细胞转录本出现在炎症前沿和免疫相关细胞簇中。这些结果强调了参与免疫抑制机制的多种细胞类型，包括诱导DC和耗竭T细胞共抑制基因表达和Tregs的招募。

图2 肿瘤前沿异质性与免疫抑制机制[1]

» 细胞通讯机制：配体-受体库数据分析显示，TSK除了参与广泛的自分泌和旁分泌相互作用外，TSK还可通过配体受体对PGF-FLT1调节内皮细胞，并通过TCGA数据库确定TSK细胞与TME改变有关。结果表明单细胞和空间数据映射的配体-受体网络与特定细胞类型的整合，揭示了TSK细胞是细胞间通讯的枢纽。扩展到临床研究发现TSK特异基因ITGB1和PLAU的高表达与无进展生存率显著降低相关，因此针对TSK亚群的研究可能会改善免疫治疗疗效。

图3 单细胞和空间数据映射的配体-受体网络分析图[1]

MIBI技术-验证单细胞空间组织定位

利用多重离子束成像（MIBI）技术，结果显示MIBI分析的主要细胞类型与单细胞数据聚类后的细胞类型相似，另外肿瘤浸润机制表明，Treg定位可能阻止效应淋巴细胞进入肿瘤。

图4 炎性 TME 的单细胞空间结构 [1]

功能验证- cSCC肿瘤细胞亚群的基因功能鉴定

利用小鼠模型来评估cSCC肿瘤细胞亚群的基因功能，异种移植模型概括了cSCC ITH的关键特征。并利用CRISPR/Cas9筛选来评估肿瘤KCs亚群的基因功能，发现参与细胞周期的基因是肿瘤循环KCs特有的，找到了可能控制亚群特异性致瘤功能的关键基因。

图5 cSCC 肿瘤细胞亚群的基因功能鉴定[1]

课题思路总结

随着科学研究的不断深入，空间转录组测序的需求不断上升，促进了空间转录组技术的不断优化，但由于空间转录组测序并不能获得单个细胞的信息，因此更多的学者倾向于空间转录组和单细胞转录组联合分析。可以探究不同空间位置的细胞特点、免疫环境状态、应激水平以及细胞之间相互作用的模式。尤其是一些高水平文章的发表可以帮助我们了解空间转录组和单细胞转录组技术的课题思路设计，探索组织中细胞的空间结构，解析细胞发育和疾病机制。

» 单细胞转录组联合空间转录组学：揭示人类胚胎心脏中细胞类型在空间组织中的分布特征《Cell》» 单细胞转录组联合空间转录组学：揭示胰腺导管腺癌的组织空间结构《Nature Biotechnology》

参考文献

1.Ji A L, Rubin A J, Thrane K, et al. Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma[J]. Cell,2020.

2. Asp M, Giacomello S, Larsson L, et al. A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart[J]. Cell, 2019, 179(7):1647-1660.e19.

3. Moncada R, Barkley D, Wagner F, et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas[J]. Nature Biotechnology, 2020: 1-10.