本文选自nature，https://doi.org/10.1038/s41586-019-1705-2，喜欢的可以自行下载。

摘要：铁死亡是一种调节性的细胞死亡形式，由依赖于铁的脂质过氧化引起。谷胱甘肽依赖的脂质氢过氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)通过将脂质氢过氧化物转化为无毒的脂醇来预防铁死亡。铁死亡以前被认为与几种退行性条件下的细胞死亡有关，通过抑制Gpx4诱导铁死亡已经成为触发癌细胞的一种治疗策略。然而，不同癌细胞系对Gpx4抑制剂的敏感性差异很大，这表明对铁死亡的抗药性是由额外的因素控制的。在这里，利用人工合成的致死性CRISPR-Cas9筛查，我们确定铁死亡抑制蛋白1(FSP1)(以前称为凋亡诱导因子线粒体2(AIFM2))是一种有效的铁死亡抵抗因子。我们的数据表明，肉豆蔻酰化作用将FSP1招募到质膜上，在那里它作为氧化还原酶发挥作用，还原性辅酶Q10(CoQ)(也称为泛醌-10)，辅酶Q10(CoQ)也被称为泛醌-10，作为一种亲脂的自由基捕获剂，阻止脂质过氧化物的传播。我们进一步发现，FSP1的表达与数百种癌细胞的铁死亡抵抗呈正相关，并且FSP1介导了培养的肺癌细胞和小鼠肿瘤异种移植瘤对铁死亡的抵抗。因此，我们的数据确定FSP1是非线粒体辅酶Q抗氧化系统的关键组成部分，该系统与典型的基于谷胱甘肽的Gpx4途径平行作用。这些发现明确了铁死亡抑制途径，并表明FSP1的药理抑制可能提供了一种有效的策略来增强癌细胞对铁死亡诱导化疗药物的敏感性。

Gpx4被认为是防止铁死亡的主要酶。一些癌细胞对Gpx4抑制剂的抗药性使我们寻找更多的保护途径。为了识别铁死亡抗性基因，我们使用一个针对U-2OS骨肉瘤细胞凋亡和癌症相关基因的单引导RNA(SgRNAs)亚库进行了合成致死性CRISPR-Cas9筛选，这些细胞用Gpx4抑制剂1S，3R-RSL3(以下简称RSL3)处理(图1A)。这一筛选显示，在RSL3(图1B，c，扩展数据图1A，补充表1)处理的细胞中，靶向FSP1(目前称为AIFM2)的sgRNAs实质上是不富集的，这表明FSP1基因的缺失与RSL3处理相结合对肿瘤是致命的。

高端大气上档次

FSP1最初被命名为AIFM2，是因为它与线粒体促凋亡蛋白7，8-凋亡诱导因子(AIF或AIFM1)的同源性。然而，正如我们在这里报道的那样，FSP1在AIF中缺乏线粒体的N端靶向序列，不定位于线粒体，也不促进凋亡。我们将AIFM2重命名为FSP1，以反映其细胞功能，如本研究所述。

FSP1 is a potent ferroptosis suppressor

使用延时显微镜对细胞活力进行定量分析显示，FSP1基因敲除（FSP1KO）细胞系对RSL3的敏感性显着提高（图1d–f，扩展数据图1b，补充表2），通过表达未加标签的FSP1（扩展数据图1c，d）显示，FSP1的过表达不会诱导细胞凋亡（图1e，f的扩展数据），而p53的激活并不增加FSP1的表达（图1g的扩展数据）。

FSP1 KO细胞显示出对其他铁死亡诱导剂的敏感性增加，包括GPX4抑制剂ML162和系统xc-抑制剂erastin2（参考文献9）（扩展数据图1h），但对复合体I抑制剂鱼藤酮或过氧化氢没有敏感性（扩展数据图。1i–l）。经铁螯合剂去铁胺（DFO）和自由基捕获抗氧化剂Ferrostatin-1（Fer1）和艾地苯醌（图1g）拯救了经RSL3处理的FSP1 KO细胞的活力，但未通过凋亡抑制剂（ZVAD（OMe）-FMK）或坏死抑制剂（necrostatin-1）拯救生存能力。（扩展数据图1m）。

FSP1KO ACSL4KO细胞对RSL3的抵抗力恢复到与单独敲除ACSL4（ACSL4 KO）相似的程度（图1h，扩展数据图1n），与ACSL4介导的多不饱和脂肪酸掺入磷脂诱导铁死亡结果一致，综上，这些发现表明FSP1是强效的铁死亡抑制因子。

这里可以看到FSP1敲掉以后似乎GPX4代偿性升高了

Plasma-membrane FSP1 blocks ferroptosis

FSP1包含一个短的N端疏水序列和一个标准的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性氧化还原酶结构域（扩展数据图1o）。

FSP1先前已在脂滴上检测到。为了进一步定义FSP1的定位，我们将C末端卤化酶标签（HaloTag）插入FSP1基因组位点（图2a）。与异位表达的野生型FSP1在C末端用绿色荧光蛋白（FSP1（WT）–GFP）标记（扩展数据图2a，b）相似，FSP1-HaloTag定位在脂质液滴的外围和质膜上（图2b，扩展数据图2c，d）。FSP1-HaloTag未与融合有Sec61的蓝色荧光蛋白标记的内质网（BFP-Sec61）或与MitoTracker标记的线粒体共定位（扩展数据图2g，h）（这个好像和上一篇文章说的不一样啊），这与不存在内质网或线粒体一致FSP1中的靶向基序。我们注意到了肉豆蔻酰化的N末端共有序列（图2c），一种脂肪酸修饰，已知在膜靶向中起作用。

FSP1肉豆蔻酰化使用点击化学方法进行了测试，该方法能够对肉豆蔻酰化的蛋白质进行亲和纯化（扩展数据图3a）。使用这种方法，从富含脂质小滴的浮力级分（扩展数据图3b）和全细胞裂解物中（图2d）亲和纯化内源FSP1。

FSP1（WT）–GFP的肉豆蔻酰化被N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT）的抑制，FSP1的甘氨酸突变为丙氨酸（FSP1（G2A）–GFP）以及翻译抑制剂依米丁的处理而被阻止（图2。2d，扩展数据图3c）。FSP1肉豆蔻酰基化的化学和遗传扰动阻止了FSP1募集到脂质小滴（图2e，扩展数据图3d，e）。

尽管通过全内反射荧光（TIRF）显微镜在质膜附近观察到一部分FSP1（G2A）–GFP（扩展数据图2f），但碘克沙醇（OptiPrep）梯度中的细胞器分级显示FSP1（G2A））–GFP在质膜中富集的馏分中含量较低（图2f，g，扩展数据图2i）。总之，这些结果表明FSP1的肉豆蔻酰化介导了该蛋白向脂质小滴和质膜的募集。

高大上的实验，根本看不懂

FSP1(WT)-GFP的表达，而不是FSP1(G2A)-GFP的表达，挽救了FSP1KO细胞对RSL3的抗性(图2H，扩展数据图3F)，这表明FSP1必须被肉豆蔻酰化才能抑制铁死亡。

我们产生的融合蛋白选择性地靶向FSP1(G2A)-GFP到内质网(细胞色素b5的氨基酸100-134；CB5)、线粒体膜外膜(TOM20信号序列，TOM20(SS))、脂滴(PLIN2)和质膜(Lyn激酶的前11个氨基酸；LYN11)(扩展数据图4A，b)。只有针对质膜的FSP1(LYN11-FSP1(G2A)-GFP)的表达足以恢复FSP1 KO细胞的铁死亡抵抗(图2I，扩展数据图4C)。相反，针对内质网、线粒体或脂滴的FSP1(G2A)-GFP的表达没有影响(图2I)。

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与先前在HT1080细胞中的结果一致，使用二酰甘油酰基转移酶抑制剂(DGAT1和DGAT2)耗尽脂滴并没有影响铁死亡的敏感性(扩展数据图5a-c)，这为FSP1介导的抑制铁死亡不需要脂滴定位的结论提供了支持。

因此，FSP1的质膜定位对于提高铁死亡抗性是必要的，也是充分的。

FSP1 reduces CoQ to suppress ferroptosis

在基础条件下，比率荧光脂质过氧化传感器BODIPY581/591C11在对照组和FSP1KO细胞中显示出相似的氧化水平(图3A，扩展数据图6A，b)。然而，与对照相比，RSL3的短暂处理显著增加了FSP1 KO细胞中的C11氧化(图3A，扩展数据图6A，b)。在FSP1 KO细胞中谷胱甘肽水平没有受到影响(扩展数据图6C-e)，表明FSP1的缺失并不抑制系统XC−或谷胱甘肽的合成。

含有多不饱和脂肪酸的磷脂水平降低，相应的溶血磷脂增加(扩展数据图6f，g，补充表3)，这是铁死亡的一个已知的脂质特征，反映了氧化性多不饱和脂肪酸从磷脂3，12的sn-2位置上的去除。这些结果表明，即使在Gpx4功能正常的情况下，FSP1的丢失也会导致磷脂氧化增加，并且FSP1通过一种不同于谷胱甘肽依赖的保护途径的机制来防止脂质过氧化。

在体外中，FSP1作为一种依赖于NADH的辅酶Q氧化还原酶发挥作用。还原性的辅酶Q可以起到捕捉自由基的抗氧化剂的作用，而艾地苯酮-辅酶Q的可溶性类似物-足以抑制脂质过氧化(扩展数据图7A)和铁死亡(图1G)。

以前的研究已经在非线粒体，而是包括质膜中检测到高水平的辅酶Q，但是这个分子在这些部位的功能还不清楚。为了研究FSP1辅酶Q氧化还原酶活性在抑制铁死亡中的作用，我们突变了一个保守的谷氨酸残基(AIF中的E313或FSP1中的E156)，这是AIF与其辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸结合所必需的(扩展数据图7b，c)。

FSP1(FSP1(E156A)-GFP)中的E156突变并不影响FSP1-GFP的表达或定位(扩展数据图3F，7d，e)，但在体外极大地削弱了FSP1介导的辅酶Q1和Reazurin的还原(扩展数据图7f-h)，并取消了FSP1-GFP拯救FSP1 KO细胞对RSL3耐药性的能力(图3B)。

与这些发现一致的是，FSP1(WT)-GFP的表达，而不是FSP1(E156A)-GFP的表达，增加了还原型辅酶Q的比率(图3C)。通过用4-氯苯甲酸(4-CBA)抑制辅酶Q生物合成酶COQ2，使细胞辅酶Q水平急剧降低，使对照细胞和FSP1KO细胞对RSL3诱导的铁下垂有强烈的敏感度(图3D，e，扩展数据图8A)。用4-CBA处理也抑制了FSP1(WT)-GFP拯救FSP1 KO细胞的能力(扩展数据图8B)。

在对照组，COQ2被敲除后观察到类似程度的对RSL3的敏化，但是在FSP1 KO细胞并未发现(图3F，g，扩展数据图8C)，COQ2KO细胞在用被DFO和艾地苯酮抑制的RSL3处理后，显示出C11氧化增加(扩展数据图8D，e)。这些数据表明，FSP1和辅酶Q合成机制在抑制脂质过氧化和铁死亡方面的作用是相同的。

NQO1是一种醌和辅酶Q氧化还原酶，以前被认为在铁死亡中起作用，它的缺失不会影响对RSL3的敏感性，但同时缺乏FSP1和NQO1(FSP1KO NQO1KO)的细胞比FSP1 KO细胞更敏感(扩展数据图9a-c)。

即使当靶向质膜(LYN11-NQO1-GFP)(扩展数据图9H，I)时，NQO1-GFP也不能像FSP1-GFP(扩展数据图9D-g)那样挽救FSP1 KO细胞的铁死亡(扩展数据图9H，I)。这些结果表明，FSP1通过降低辅酶Q来抑制铁死亡的能力是独一无二的。

FSP1 in cancer ferroptosis resistance

癌症治疗反应门户网站(CTRP)报告了800多种癌症细胞系的基因表达和耐药性之间的相关性。从CTRP挖掘的数据表明，FSP1的表达与对多种Gpx4抑制剂(RSL3、ML210和ML162)的耐药性呈正相关(图4A，b，扩展数据图10A，b，补充表4)-甚至比系统XC−组件和Erastin靶标SLC7A11更相关。

因此，FSP1在许多类型的癌症中是铁死亡抵抗的生物标志物。与CTRP中观察到的相关性一致，表达低水平FSP1的肺癌细胞系对RSL3最敏感，表达高水平FSP1的细胞系最具耐药性(图4B，扩展数据图10C)。

在高耐药的H460细胞中敲除FSP1导致对RSL3的敏化显著，约为100倍(图4D，扩展数据图10D，e)，在敏感的H1703和H446细胞中过表达FSP1-GFP使对RSL3的耐药性增加约10-20倍(图4e，扩展数据图10F-I)。

为了检验抑制FSP1可能是一种临床上相关的方法来使肿瘤对铁死亡激活的化疗药物敏感，我们在一个临床前肿瘤异种移植小鼠模型中使用了铁死亡抗性的H460肺癌细胞。我们采用了一种最近开发的策略，使用Gpx4基因敲除(GPX4KO)细胞在活体中诱导铁死亡(扩展数据图10j)。

这些细胞系被保存在含Fer-1的培养基中，以防止铁死亡的诱导。Fer-1清除对GPX4KO细胞的活性没有影响，但导致GPX4 KO FSP1 KO细胞的迅速死亡(图4F)，这与我们的发现一致，即FSP1补偿了Gpx4活性的丧失。

用GPX4 KO和GPX4KO FSP1 KO H460细胞系产生肿瘤异种移植瘤，每天注射Fer-1以使肿瘤存活。肿瘤建立后，在一组小鼠中停止注射Fe1，以诱导铁死亡（GPX4敲除细胞仍导致肿瘤细胞持续增大，并不受FER-1的影响）。FER1停用导致GPX4KO FSP1KO肿瘤的生长显著减少(图4G)。

这些数据表明，当Gpx4失活时，FSP1在体内维持了H460肺癌肿瘤的生长。为了确定是否可以通过阻断胱氨酸输入来抑制FSP1 KO肿瘤的生长，我们用咪唑-酮-ERASTIN(IKE)处理H460细胞，IKE是一种系统的XC−抑制剂，可以在活体体内诱导铁死亡。虽然U-2OS和H460 FSP1 KO细胞在细胞培养中对IKE的敏感性增加(扩展数据图10i，m)，但IKE并不抑制野生型H460和H460 FSP1 KO肿瘤异种移植瘤的生长(扩展数据图10n，o)。

因为细胞可以通过使用替代途径来产生谷胱甘肽来克服胱氨酸耗竭的影响，我们的结果强调了在体内有效的Gpx4抑制剂的必要性。

铁死亡已经成为退行性疾病中细胞死亡的一个潜在原因，也是一种很有希望的策略，可以诱导对其他疗法耐药的癌细胞死亡。我们的研究和一篇配套论文的研究发现，FSP1是一种有效的铁死亡抑制因子，与典型的谷胱甘肽依赖的Gpx4途径平行工作。FSP1KO小鼠是存活的，没有表现出明显的突变表型，这与Gpx4对脂质过氧化的代偿抑制是一致的。从机制上讲，我们的数据支持一个模型，在该模型中，肉豆蔻酰化作用将FSP1靶向质膜，在那里它介导了依赖NADH的辅酶Q的还原，而还原性辅酶Q的功能是一种捕捉自由基的抗氧化剂，可以抑制脂质过氧化物的传播(图4H)。我们的数据还显示，非线粒体辅酶Q的一个基本作用是作为抗氧化剂发挥作用，防止脂质损伤，从而防止铁死亡。FSP1在脂滴上的定位不是预防铁死亡所必需的。一种可能性是，FSP1介导的脂滴中亲脂性自由基捕获性抗氧化剂的调节对于在长时间的脂质储存期间维持脂质质量是重要的（也就是这种FSP1在脂滴中的存在是保持脂滴的还原状态，避免被氧化），类似于辅酶Q和生育酚在防止循环脂蛋白颗粒氧化方面的功能。最后，我们的研究结果表明，FSP1的表达对于预测铁死亡诱导药物在癌症中的疗效很重要，并突出了FSP1抑制剂作为一种策略在多种癌症中克服铁死亡耐药性的潜力。

两篇文章读完，我傻了，同样的题目，同样的内容，做了一致的结果，居然都标榜自己是第一个发现的人，彻底裂开，这种蛋白定位在两篇文章中的说法还不太一致，我崩溃。为什么FSP1在脂滴中富集并且还不起作用并没有阐明，也没有说脂滴中的FSP1具体功能，还是需要后人继续努力啊。欢迎批评、指正