外源基因在G0代转基因家畜中的整合状况
背景
- G0代，由转基因的胚胎发育成的转基因动物。
- 整合一般具有稳定性，大部分以孟德尔方式遗传给后代，少部分为嵌合体，极少数转基因未整合到染色体上，而是以附加体形式存在，并可传至后代。
- G0代转基因家畜遗传稳定性以及表达水平，则与外源基因整合的位点和整合的状况有关。
- 按目前的转基因技术，G0代转基因猪外源基因一般只是整合在同源染色体中的一条染色体上，可称其为“杂合体”。只有获得“纯合体 ”(同源染色体上的相同位点都整合有外源基因)，才能进行下一步的建立家系、品系等育种工作。
- 目前的转基因技术，外源基因的整合有两种情况：一种是随机整合；另一种是定位整合。外源基因的定位整合，一般是通过基因打靶技术实现的。
正文
1. 随机整合
1.1 转基因动物的嵌合体现象
所谓转基因动物嵌合体是指：转基因动物由转基因的和非转基因的两种细胞、或由两种或两种以上不同类型的转基因细胞构成。
下列几种情况，有可能导致转基因嵌合体的产生：
其一，与外源基因整合的时机有关，如果整合发生在第一次卵裂前, 即发生在 DNA 合成的 S 期, 外源基因将随染色体的分离均匀地分布到每一个细胞, 得到的转基因动物是纯合体, 反之, 得到的将是嵌合体。 显微注射转基因的实践证明, 受精卵 DNA 合成的 S 期是显微注射的适宜时机。哺乳动物受精卵的单细胞期阶段较长, 有可能在G0代得到纯合体的转基因动物。
其二，对两个细胞期以上的胚胎进行基因导入，例如对两个细胞期的胚胎进行外源基因的显微注射，多数会形成嵌合体。
其三，在胚胎细胞的分裂和分化过程中，一部分插入DNA 被修饰 ，也会形成嵌合体 。有研究表明，应用显微注射的方法进行转基因 ，嵌合体的比例大约占65％左右。
在转基因嵌合体中，如果生殖细胞中有外源基因的嵌合，则可以将转基因传递给后代；否则，就不能将转基因传递给后代 。这就是有些G0代转基因动物不能传代的原因之一。
1.2 外源基因的整合位点及其效应
- 非基因打靶的外源 DNA 导入受体细胞后将随机地插入受体基因组中的任意位置。
- 转基因的表达与其整合位点有关，不同的整合位点，表现出不一样的表达效果，称之为转基因的“位点效应 ”。 朱作言等将转基因的“位点效应 ”分为三种类 型，即“有效整合 ”、“沉默整合 ”和“毒性整合 ” 。
- 转基因的有效整合位点应具备两个特征 ：
其一， 转基因能有效表达；
其二，避免干扰基因组功能基因的表达调控或破坏基因结构。
有效整合的位点具有遗传的稳定性 - 无表达作用的整合为“沉默整合”，其整合位点常发生在染色体异染色质区 。
- “毒性整合”的位点一般在常染色区，由于干扰了基因组功能基因的表达调控或破坏了正常基因的结构，而导致胚胎或个体生长发育受阻、畸形甚至夭折。
1.3 外源基因的整合形式
DNA随机整合在染色体DNA的断裂处 ,注射的 DNA末端和染色体的断裂点之间的相互作用使外源 DNA整合进入基因组。因此微注射时 ,线性化 DNA分子比环状DNA分子整合率要高得多 ,而线性化 DNA的末端结构 (平末端或粘性末端 )对整合效率与整合分子的结构影响不大。由注入的 DNA分子游离末端所诱导的修复酶可能引起染色体的的随机断裂 ,断裂处可能就是 DNA的整合位点 ,但是导入的 DNA未必总能整合到宿主基因组中。
外源基因随机整合的形式有三种：单拷贝单一位点整合，多拷贝串联单一位点整合，多拷贝多位点整合 。
多拷贝整合，外源 DNA 通常呈现多串状整合；
在绝大多数情况下，某一位点上多拷贝串状整合的外源基因 ，采取头尾相连的排列方式；
这些方向一致的串状拷贝，是被导入DNA 的完整或近乎完整的拷贝，少数情况下也有在两个相邻拷贝结合的地方出现小的不完整；
在稀有的情况下，发现两个拷贝呈现头对头或尾对尾的连接方式，在这种情况下常发生末端缺失。
转基因的另一种变化是某些碱基被甲基化。转基因拷贝的不完整、末端缺失或甲基化，都会影响基因表达和遗传的稳定性。多拷贝串联的拷贝数可从几个到 100 个以上。
2. 定位整合
外源基因的定位整合一般是通过基因打靶实现的，基因打靶是精确地人工修饰基因组的一种技术。这种技术的特征在于：第一，具有直接性，直接作用于靶基因，不涉及基因组的其他位置；第二，具有准确性，可以将设计好的 DNA 序列插入选定的目标基因座，或者用设计好的 DNA 序列去取代基因座中相应的 DNA 序列。因此，通过基因打靶技术制备的转基因动物，应不存在转基因的嵌合体现象，其整合位点和拷贝数也应是确定的。
对于家畜而言，实现外源基因的定位整合 (或基因敲除)，必须通过核移植的程序。目前体细胞核移植生产克隆家畜的效率很低，大量的重构胚在孕育期死亡，出生后的个体生长发育不正常、甚至死亡的频率也很高。这些情况，应主要是由于克隆技术不完善而导致的；但也不能排除一部分是由于外源基因(或敲除基因)的表达或整合位点的不当所致 。
