技术升级 | 宏基因组HiFi reads获取高质量完成图

宏基因组学是研究微生物群落的常用方法之一。三代HiFi测序的出现，克服了以往宏基因组学NGS测序的短读长、准确性低的缺点，成为微生态研究领域的“新宠儿”。由于HiFi测序本身携带的种种优势，决定了它在宏基因组组装方面将会取得非凡的成绩，因此，出现了与之更加契合的组装软件来实现更高组装的水平。

2021年10月，哈佛大学医学院Dana-Farber癌症研究所李恒课题组重磅推出三代HiFi宏基因组组装软件——hifiasm-meta。研究论文“Metagenome assembly of high-fidelity long reads with hifiasm-meta”预印本在线发布。作者使用模拟菌群和实测样本，评估了hifiasm-meta软件组装效果，对比了HiCanu、metaFlye、MetaBAT2软件的结果和性能，发现使用hifiasm-meta软件可以得到更多的环状MAGs，性能上也略胜一筹。将肠道内容物样本进行宏基因组HiFi测序，使用hifiasm-meta和metaFlye两款软件进行组装比较，让我们来一探究竟吧！

数据质控

对4个肠道内容物样本进行HiFi宏基因组测序，得到23Gbp左右数据量，N50 read长度为20Kbp左右，质控结果如表1所示：

表1 HiFi宏基因组测序质控结果

组装结果

质控后的数据分别使用hifiasm-meta 和metaFlye软件进行组装，过滤500bp以下的contigs，如表2所示，结果发现使用hifiasm-meta软件组装的4个样本的总长度和平均长度均长于metaFlye软件组装的结果，Contig N50 长度相比变短，GC含量基本不变。

表2 hifiasm-meta和metaFlye软件组装结果

图1和图2分别为样本组装后contig总长度和平均长度的比对折线图，从图中可以更加明显的看出，使用hifiasm-meta软件进行样本组装，组装水平得以显著提高，contig总长度至少提高50%，其中gut3增加了2.7倍！大大增加获得更完整基因组序列的可能性！

使用CheckM检测组装完整性和污染度，定义“近完成图（near-complete）“为完整性≥90%，污染度≤5%的contigs，“high-quality”为完整性≥70%，污染度≤10%的contigs。下表3为contig长度大于1M的检测结果，我们发现hifiasm-meta软件组装的contigs数量、近完成图和high-quality的数量均显著多于metaFlye的组装。其中，gut1样本中，hifiasm-meta重建了124个长度＞1Mb的contigs，有14个近完成图，其中2个是环状contigs。

表3 CheckM 检测结果

ORF预测

将两种软件的组装结果分别进行ORF预测，如下表4。结果显示，使用hifiasm-meta软件组装得到的ORF数量和ORF总长度比metaFlye均有所提高，ORF完整性相比也略有提升！

表4 ORF预测结果

注：Integrity:all：包含起始密码子和终止密码子的ORF。 

软件性能

对hifiasm-meta和metaFlye软件进行性能统计，发现使用hifiasm-meta软件组装肠道内容物，需要32个CPU，大概30个小时左右，与metaFlye所需时间相当。

总体而言，hifiasm-meta相比metaFlye 软件可以获得更多更完整的基因组，从而提高注释准确度和分辨率，挖掘更深层次功能等。

HiFi宏基因组测序相比传统测序的优势如下：

测序：长度长、准确度高，无GC偏好性，可跨越长复杂区域

组装：无需二代矫正，大幅提升组装完整性和连续性，可达完成图水平

应用：人体微生态领域（代谢类疾病、消化道疾病、免疫力疾病、肝病、癌症等）；动物营养、免疫及治疗领域；土壤、活性污泥、废水等环境领域；根际微生物等植物领域 

PS：

预印论文参见：

https://arxiv.org/pdf/2110.08457.pdf

代码和使用说明等参见：

https://github.com/xfengnefx/hifiasm-meta