10X单细胞空间联合分析揭示了前列腺肿瘤微环境的异质性

hello，周四了，这是第399篇文章，不知不觉中，已经写了很多了，但是前进的脚步是不能停止的，感觉自己要进入下一个阶段了，因为不能仅仅局限于分享别人的内容，要提升自己，就需要自己来合作发文章了。

今天我们继续分享单细胞空间联合分析的方法文章，在Integrated single-cell and spatial transcriptomic analyses unravel the heterogeneity of the prostate tumor microenvironment，现在的文章用到单细胞空间联合的，都发的很高，物以稀为贵，如果大家有单细胞空间的样本要分析，请抓紧，现在发，发到Cell也很有可能。

先放上细胞定义的marker

细胞类型	细胞markers
Mast cells	TPSAB1 CPA3 HPGDS RGS13 IL1RL1 KIT GATA2 FOSB RP11-354E11.2 VWA5A SLC18A2 HDC CAPG TPSAB1 CPA3
Endothelial cells	RAMP2 TM4SF1 RNASE1 EGFL7 RAMP3 PLVAP AQP1 ECSCR FKBP1A AC011526.1 EMP1 DARC VWF EMCN
Pericytes	RGS5 ACTA2 MYH11 MT1M FRZB MT1A NDUFA4L2 PPP1R14A MYLK PHLDA1
Fibroblasts	DCN LUM PTN IGF1 APOD COL1A2 FBLN1 MEG3 CXCL12 PDC IRF7 IRF4 LILRA4 PPP1R14B SOX4 TSPAN13 KIAA0226 PTCRA RAB11FIP1 CXCR3 IL3RA
B cells	MS4A1 CD79B BTG1 VPREB3 BANK1 CD79A IGLL5 MS4A1 CD79B BTG1 VPREB3 BANK1 CD79A IGLL5 MS4A1
Plasma cells	SEC11C XBP1 PRDX4 SPCS2 SSR3 SDF2L1 C19orf10 MANF TMEM258 DNAJB9
Macrophage	C1QA C1QC C1QB GPR34 CSF1R MS4A4A
Monocytes	S100A9 FCN1 S100A8 CSTA EREG NEAT1 TKT THBS1 VCAN TSPO CSTA
mDC	CD1C PKIB INSIG1 CLEC10A C15orf48 PPA1
NK	NKG7 GNLY KLRD1 KLRB1 FGFBP2 PRF1 NKG7 GNLY KLRD1 KLRB1 FGFBP2 PRF1 NKG7 CTL CD8A CD8B GZMH GZMA PTPRC
Naive Th	CCR7 SELL
Th1	CD4 IL2 TNF
Treg	TIGIT CTLA4 SOD1 TNFRSF4 TNFRSF18 RTKN2 FOXP3 TIGIT CTLA4
Epithelial Club	SCGB1A3 WFDC2 LCN2 MMP7 KRT4 TACSTD2 SCGB3A1
Epithelial Hillock	KRT13 S100A16 S100A14 KRT19
Epithelial Basal	TP63 KRT14 KRT5
Epithelial Luminal	KLK4 KLK3 KLK2 ACPP AR
Tumor	AMACR CACNA1D PCA3 ERG FABP5 COL9A2 GCNT1 PHGR1 Th17 IL17A IL17F RORC CD4 CCL20 CCR6 RORA
CD8+ effector	CD8A CD8B IFNG GZMK
CD56bright NK	KLRC1 CD44 COTL1 XCL1 XCL2 TBX21 EOMES
CD56dim NK	GZMB FGFBP2 PRF1 FCGR3A TBX21
NKT	CD44 CD8A CD3D NKG7

Highlights

● Characterization of prostate cancer by combined scRNA-seq and spatial transcriptomic analysis
● Primary prostate cancer establishes a suppressive immune microenvironment
● The prostate tumor microenvironment exhibits a high angiogenic gene expression pattern
● A new computational analysis pipeline to deconvolute context-specific differential gene expression

先来简单总结一下重点

• 分析点1 细胞丰度的变化，尤其是免疫细胞
• 空间组织的研究（肿瘤状态下相对于正常组织的破坏程度）
• 空间临近通讯（配受体的空间阻隔作用，空间邻近性可能是识别相关交互的一种过滤器）
• 肿瘤中巨噬细胞的作用（M1，M2）

Summary

原发性前列腺癌的治疗巧妙地平衡了低风险疾病的主动监测方法与多模式治疗，包括手术、放射治疗和高风险疾病的激素治疗。转移性疾病的复发和发展仍然是一个临床问题，没有清楚地了解是什么驱动了免疫逃逸和肿瘤进展。在这里，研究试图全面描述局部前列腺癌的肿瘤微环境，并将其与相邻的正常样本和健康对照进行对比。分析进行了单细胞 RNA 测序和高分辨率空间转录组分析。这揭示了基因表达的肿瘤背景依赖性变化。数据指向与抑制性骨髓种群和耗尽的 T 细胞相关的免疫抑制性肿瘤微环境，以及高基质血管生成活性。分析以前所未有的规模推断了未解离组织切片中配体-受体相互作用的细胞间关系。

Introduction

Localized prostate cancer 是一种临床异质性疾病。 一些患者患有可以安全观察的惰性低风险前列腺肿瘤，而另一些患者则患有侵袭性高风险疾病，即使在最先进的治疗后也具有很大的复发风险。 尽管努力早期发现和改进目前的治愈性治疗，但不幸的是，许多患者经历了复发和疾病进展。 所以仍然非常需要进一步了解前列腺癌，其中前列腺肿瘤微环境 (TME) 的生物学见解可能有助于确定新的治疗靶点。 这里检查了前列腺 TME 内的支持性细胞状态和分子关系，以确定驱动肿瘤生长的变化。

单细胞基因表达技术使评估单个样本中的数千个细胞成为可能，揭示了肿瘤细胞异质性和复杂 TME 的subtletie。 对正常成人前列腺和前列腺癌的检查提供了对前列腺腺癌和神经内分泌肿瘤中上皮细胞和肿瘤细胞以及细胞状态的详细研究。 然而，前列腺微环境中的免疫细胞尚未在单细胞水平上进行严格的表征。 前列腺 TME 通常包含很少的免疫细胞，据推测，这一特征可以解释前列腺癌对免疫治疗的普遍反应不佳。 因此，使用富集和保存免疫细胞群的方法处理新鲜的前列腺和肿瘤样本，以便以高分辨率表征免疫微环境。

为了验证单细胞的发现，使用了 parallel spatial transcriptomic technique (Slide-seqV2)，其中保留了组织结构和细胞-细胞邻近关系。 因此，还表征了来自低风险和高风险前列腺癌患者的肿瘤空间组织。 此外，分析开发了一种新的数据分析计算方法，以检查肿瘤细胞对邻近基质细胞（包括成纤维细胞、周细胞和内皮细胞）的转录影响。

Together, this work provides a compendium of the prostate TME with a particular focus on immune populations. We further reveal the transcriptional state of stromal cells based on their spatial localization within the tumor. In sum, our data reveal a highly immune suppressive TME and describe tumor-induced alterations of neighboring cells that promote tumorigenesis and progression.

Results

The prostate TME characterized by single-cell and spatial transcriptomic analysis

从 19 名被诊断患有前列腺腺癌并接受根治性前列腺切除术的初治患者中收集了新鲜的前列腺癌样本。 在 19 名患者中的 14 名中，还对与肿瘤相邻的匹配的“正常”良性前列腺组织进行了取样。 作为对照，从 4 名患者（因膀胱癌接受膀胱前列腺切除术）采集未患癌症的前列腺组织样本，并从一名转移性非小细胞肺癌患者的快速尸检中采集了一个健康的前列腺。

在一系列原发性肿瘤等级和阶段中检查了前列腺 TME 的细胞组成。 样品分为low-grade and high-grade。 通过荧光激活细胞分选 (FACS) 从健康前列腺组织 (n=5)、前列腺肿瘤组织 (n=12 LG 和 n=7 HG) 和邻近的非红细胞中收集活的非红细胞 (DAPIneg/CD235neg) 肿瘤涉及前列腺组织（n = 11 LG 和 n = 4 HG，以下称为“相邻正常”）。 我们从 14 名患者中收集了成对的肿瘤组织和邻近正常组织样本（n=10 LG 和 n=4 HG）。 所有患者均进行标准病理评估以确认其诊断。

分析了 179,359 个单细胞的转录组（平均每个样品 4,721 个细胞和每个细胞 50,416 个转录本）。 Conos (Clustering On Network Of Samples) 对样本进行了aligned，对产生的联合细胞clusters的分析揭示了丰富的免疫细胞和非免疫基质细胞。 根据细胞类型特异性基因标记对细胞类型进行注释，形成 16 个主要clusters。

值得注意的是，解离方案经过优化以富集免疫细胞。 这是一个专注于前列腺免疫 TME 的有意选择，目的是了解为什么前列腺癌被认为免疫原性差，因此很少对免疫治疗产生反应。 在将组织处理方法（胶原酶+分散酶）与已发表的单细胞前列腺研究方案（Rocky）进行比较时，胶原酶+分散酶释放了更高比例的免疫细胞。 令人欣慰的是，两种解离方案释放的细胞显示出相似的转录组谱。

就主要细胞群的丰度而言，在将肿瘤样本与相邻正常样本进行比较时，在浆细胞、巨噬细胞和内皮细胞的整体水平上观察到了显著但很小的绝对差异。 对低级别 (LG) 和高级别 (HG) 病例进行分层，浆细胞（adj-正常与肿瘤，LG）、巨噬细胞（adj-正常与肿瘤，LG）和内皮细胞（ 健康与 adj-N LG）。 即使在具有相同 Gleason 评分的患者中，细胞丰度的少数显著差异也可能是由于患者之间的高变异性。

使用加权表达距离检查样本之间转录状态的总体相似性，显示与调整正常和健康部分相比，肿瘤部分之间的患者间变异性显著增加。 这表明不同患者肿瘤区域中细胞状态的不同轨迹。

为了使用保留组织结构的无解离方法验证单细胞发现，使用 Slide-seqV2 进行了空间转录组学。 这提供了以高空间分辨率检查肿瘤组织的机会。 新鲜冷冻的 10 微米切片取自健康前列腺样本和两个前列腺肿瘤样本（一个低级和一个高级）以及它们相应的邻近正常组织 。

稳健的细胞类型分解 (RCTD) 用于根据 scRNA-seq 参考数据分配细胞类型注释（大家可以参考文章10X单细胞空间联合分析之十（RCTD））。 表示不同细胞群的标志基因用于验证 RCTD 注释。 正如预期的那样，与 scRNA-seq 数据相比，Slide-seqV2 测量结果显示细胞比例差异更明显，上皮细胞和成纤维细胞群大大增加，免疫细胞比例显著减少。

通过 Slide-seqV2 的镜头观察到的细胞结构与人们对标准 H&E 染色的预期完全一致。 健康前列腺组织的高度详细的空间配置显示了组织良好的前列腺上皮腺体，周围环绕着免疫和非免疫基质细胞，包括成纤维细胞、周细胞、肥大细胞和内皮细胞。 这种结构在癌性前列腺中被明显破坏。 使用 Moran's I 评分通过空间自相关来量化组织组织的差异，该评分评估细胞聚集（高分）或分散（低分）的程度。 与健康组织相比，肿瘤中成纤维细胞、内皮细胞和周细胞的 Moran's I 评分显著降低。

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A Prostate Tumor Gene Signature distinguishes normal and malignant luminal epithelial cells

无监督聚类揭示了四个上皮亚群：basal, luminal, club, and hillock，由关键标记基因表达表示。 club and hillock细胞被确定为小鼠肺细胞图谱中的过渡细胞。 这些细胞在人类前列腺组织和良性人类前列腺类器官中也有报道，但它们在前列腺肿瘤发生中的作用仍不清楚。

使用 RNA 速度来推断上皮细胞分化的可能轨迹。 一条轨迹表明，club细胞充当腔细胞祖细胞，这是先前在前列腺癌中报道的观察结果。 第二个不同的轨迹显示一致的定向流动，表明hillock细胞可能充当基底细胞的祖细胞。 比较健康和肿瘤相关hillock和club细胞的差异基因表达分别显示参与泌尿生殖系统发育和上皮管形态发生的基因富集，并且已知这些细胞在尿道和尿道周围前列腺区富集。

Chromosomal aberrations和 inferCNV 分析使我们能够将恶性管腔细胞（具有基因组畸变）与肿瘤内的正常管腔细胞分开。 DEG 分析用于识别恶性细胞的表达特征，导致由八个基因组成的特征，我们将其称为“前列腺肿瘤基因特征”。 我们将此基因特征应用于已发表的前列腺组织的bulk RNA-seq，证明了在四个独立数据集中区分肿瘤样本与相邻正常样本的一致能力。

由于能够将肿瘤样本中的恶性细胞与正常上皮细胞区分开来，因此评估了异质性。 恶性细胞的独立成分分析 (ICA) 揭示了恶性clusters的三个主要方面。 基因 (GO) 通路分析显示恶性cluster 1 (C1) 中细胞生长和上皮细胞迁移相关基因的富集。 cluster 1 还显示 EGR1、IER2 和 KLF6 基因的高表达，表明在前列腺癌进展、运动和转移中的作用。

上皮间质转化（EMT）在前列腺癌的进展和转移中起重要作用。 与来自三种不同样本类型（健康、调整正常和肿瘤）的非恶性管腔细胞相比，恶性细胞显示出显著更高的 EMT 基因特征。

在空间上，健康的前列腺表现出有组织的腺上皮，具有结构良好的基底细胞和腔细胞双层。 调整正常样本随着管腔上皮群体的扩大和组织良好的腺体的丧失而不同。 使用 RCTD 注释上皮亚群并使用上皮细胞类型特异性标记基因进行验证。 如空间自相关所示，肿瘤和调整正常样本中的棒状细胞和hillock细胞的正常cluster被破坏。

从单细胞实验中获得的“前列腺肿瘤基因特征”应用于 Slide-seqV2 结果。 这种八基因肿瘤特征成功识别了从 HG 病例中收集的肿瘤细胞。 在健康和调整正常的样本中几乎没有这样的细胞被注释，这说明了这个“前列腺肿瘤基因特征”的准确性。

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Context-dependent differential expression with linear admixture correction

扩大肿瘤的边缘或边界在 HG 样本中特别明显，可以分割成两个不同的空间背景。 肿瘤环境以肿瘤细胞的密集积累为主，而与肿瘤相邻的环境主要由非恶性上皮细胞组成。 在调整正常样本中检测到的一小部分肿瘤细胞可能代表肿瘤细胞的真实浸润。 Slide-seqV2 允许人们检查与精确空间背景相关的细胞状态差异。 RCTD 等注释工具估计对每个spot有贡献的细胞类型的分数，并确定可以自信地分配给特定细胞类型的相对纯的spot。 然而，即使是“纯”spot也可以携带来自相邻细胞的转录组混合物。

由于细胞邻域的组成在不同的组织环境之间变化，这种混合物将严重偏向环境之间细胞状态的转录比较。 为了克服这种混合效应，开发了一种新的计算方法，它消除了可能归因于来自其他细胞类型的混合的背景相关差异，重点关注可能反映靶细胞类型转录状态的背景相关变化的残余差异。 在随后的部分中，应用这种方法来对比肿瘤和肿瘤相邻环境之间的基质群体的状态。

The prostate tumor microenvironment exhibits high endothelial angiogenic activity

非免疫基质包括成 fibroblasts, endothelial cells and pericytes，代表了 TME 的重要组成部分，其功能和丰度因癌症类型而异。 确定了五个基质亚群，包括两个内皮细胞、两个周细胞和一个基于关键标记基因表达注释的成纤维细胞亚群。

Endothelial-1 细胞显示高表达 SELE/SELP/CLU/PLVAP，这是窦状内皮细胞的特征，而 Endothelial-2 细胞表达常见的动脉基因 (HEY1/IGFBP3/FBLN5)。 Endothelial-2 细胞的基因 (GO) 分析指出了参与血管发育和血管生成的途径。 血管生成基因特征表明，与其他基质群体相比，以及在比较几乎所有群体的健康和肿瘤细胞时，与肿瘤相关的 Endothelial-2 细胞得分最高。 不同基质亚群的血管生成评分在 LG 和 HG 肿瘤样本之间没有差异。

在 Slide-seqV2 空间转录组学平台内检查 Endothelial-2 细胞的转录组变化，比较“肿瘤”和“肿瘤相邻”的背景，通路富集分析与肿瘤的单细胞数据一致，showing upregulation of sprouting angiogenesis and vascular endothelial growth factor pathways。

肿瘤环境中的Endothelial-2 细胞也显示出细胞迁移和增殖途径的上调。 这与肿瘤组织内Endothelial-2细胞的分散组织相一致，与调整正常和健康样本的组织良好的结构形成对比，这通过空间自相关分析进行了量化。 总体而言，这突出了内皮细胞与肿瘤血管化和迁移的相关性，这与前列腺癌疾病进展相关

血管周细胞是血管系统的另一个组成部分。这些细胞表现出具有多能性的间充质特征，并且它们在脉管系统发育中的作用已经确立，而它们在癌症进展中的作用尚不清楚。分析确定了两个周细胞亚群。 Pericyte-1 细胞中的表达模式富含参与细胞外结构组织和结缔组织发育的途径，而 Pericyte-2 细胞表现出与血管平滑肌细胞 (VSMC) 一致的肌肉收缩基因特征。此外，与健康前列腺相比，从癌性前列腺收集的样本中两种周细胞亚群的血管生成基因特征显著增加。在空间上，与健康和 adj 正常样本相比，Pericyte-1 细胞分散在肿瘤样本中。总之，这些数据表明周细胞在前列腺癌进展过程中的血管生成和重塑肿瘤基质中的作用。

癌症相关成纤维细胞 (CAF) 通过促进肿瘤增殖和转移、增强血管生成和介导免疫抑制，在塑造 TME 中发挥关键作用。 CAF 与许多癌症类型的不良预后相关。 在前列腺癌中，CAF 在疾病早期阶段的癌症发展中发挥着因果作用，有助于治疗抵抗和转移进展。 成纤维细胞基因表达模式显示胶原纤维组织、细胞外结构组织和结缔组织发育途径的富集。 在 Slide-seq 差异基因分析中也确定了这些相同的途径，将肿瘤与肿瘤相邻环境进行比较。 这些数据表明成纤维细胞在前列腺 TME 中诱导细胞外基质重塑中的作用，这反过来对肿瘤进展很重要。

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Coordination between tumor cells and stromal compartment in tumor context（共定位分析）

利用 Slide-seqV2 空间信息来检查肿瘤生态系统内细胞之间的潜在通信渠道。 虽然细胞间信号的重要性得到了认可，但很难推断哪些细胞相互通信以及通过哪些通道进行通信。 可能关系的预测基于配体和同源受体对的表达，通常会导致许多潜在的相互作用； 需要额外的过滤器来区分功能相关的通道。 推断空间邻近性可能是识别相关交互的一种过滤器。

这里query相应的配体和受体基因是否在直接位于每个配体和受体基因旁边的细胞中表现出协同上调。 Slide-seqV2 数据用于绘制物理相邻细胞的图形，这允许测试配体受体 (LR) 评分（定义为两个相应表达水平的乘积）是否在物理相邻细胞中显著高于空间距离较远的细胞。 从约 1200 个配体-受体相互作用的参考列表中，分析揭示了 405 个具有统计学意义的潜在沟通渠道。

以肿瘤-基质通讯为重点，我们在将肿瘤细胞视为配体来源和将基质细胞视为表达受体时研究了通讯渠道。 肿瘤细胞表达血管内皮生长因子（VEGFA 和 VEGFB），可通过 VEGF 受体、FLT1 和 β-1 整合素刺激Endothelial-2。 这些通道可能解释肿瘤相关内皮-2亚群状态的促血管生成转变。 还观察到肿瘤细胞与成纤维细胞 (COL9A2-ITGA1) 和肿瘤细胞与 Pericytes-2 细胞 (COL12A1-ITGA1) 之间的潜在相互作用，这些通路均涉及细胞外基质重塑和细胞迁移。

反向相互作用分析（即基质细胞表达肿瘤受体的配体）揭示了由成纤维细胞胰岛素样生长因子 (IGF1) 刺激肿瘤细胞 IGF1 受体介导的潜在相互作用。 已知 IGF 通路通过抑制细胞凋亡和激活细胞周期来促进肿瘤生长和存活。 IGF1-IGF1R 相互作用的 Slide-seqV2 分析证实了表达 IGF1R 的肿瘤细胞和表达 IGF1 的成纤维细胞的共定位。

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Prostate tumors are enriched in immunosuppressive myeloid cells

骨髓细胞支持几种癌症类型的肿瘤进展，这些细胞被认为是临床上最相关的群体之一，可用于免疫治疗目的。 无监督聚类揭示了 7 个骨髓亚群，包括 3 个单核细胞、3 个巨噬细胞和 1 个骨髓 DC (mDC)。 基于关键标记基因进行注释，并使用已发表的单核细胞和巨噬细胞基因特征进行验证。

单核细胞亚群的特征是 CD16hi (CD16hi Mo)，称为非经典单核细胞，肿瘤炎症单核细胞 (TIMo) 具有高表达 CD14（经典单核细胞标志物）以及炎症基因特征的最高表达。 第三个亚群被注释为单核细胞-巨噬细胞 (Mo-MΦ)，因为它显示出它们的基因表达从单核细胞中高表达的基因（例如，S100A9）到巨噬细胞中表达的基因（例如，C1QA）的逐渐转变，表明过渡细胞 从单核细胞到巨噬细胞的状态。

肿瘤细胞和基质细胞都产生参与骨髓分化过程以及单核细胞向肿瘤募集的趋化因子。 我们观察到成纤维细胞中 CXCL12、周细胞中 CCL2 和上皮细胞和肿瘤细胞中 CCL3、4 和 5 的高表达，表明成纤维细胞和周细胞在将单核细胞募集到前列腺肿瘤中的潜在作用。

前列腺癌患者对肿瘤的免疫反应无效，免疫抑制性 TME 与髓源抑制细胞 (MDSC) 的积累有关。 TIMo 细胞的 MDSC 基因特征得分最高，与健康前列腺组织相比，从癌性前列腺（肿瘤和 adj-正常）收集的细胞中的基因特征显著更高。 这表明 TIMo 亚群通过免疫抑制活性和促炎细胞因子的释放在前列腺肿瘤生长中发挥作用。

前列腺癌患者对肿瘤的免疫反应无效，免疫抑制性 TME 与髓源抑制细胞 (MDSC) 的积累有关。 TIMo 细胞的 MDSC 基因特征得分最高，与健康前列腺组织相比，从癌性前列腺（肿瘤和 adj-正常）收集的细胞中的基因特征显著更高。 这表明 TIMo 亚群通过免疫抑制活性和促炎细胞因子的释放在前列腺肿瘤生长中发挥作用。

鉴定了几个巨噬细胞亚群，包括具有高“炎症基因特征”的肿瘤炎性巨噬细胞 (TIMΦ)、具有高“抗原加工和呈递基因特征”的抗原呈递巨噬细胞 (AP MΦ)，以及 M2 巨噬细胞 (M2- MΦ) 具有高“M2 样基因特征”。 M2-MΦ 显示从健康到肿瘤部分的细胞丰度逐渐增加，并且已显示 M2 样巨噬细胞在广泛的肿瘤中抑制抗肿瘤免疫反应。 在前列腺癌中，肿瘤组织中 M2 样巨噬细胞的高度浸润与肿瘤复发和转移有关。

在与单细胞表达相同的组织样本上进行的多重免疫组织化学 (mIHC) 证实，与匹配的 adj 正常组织相比，肿瘤组织中 CD68+ 巨噬细胞和 CD68+CD163+ M2-MΦ 的浸润更高。 在高 Gleason 评分（4+4、4+5、5+5）的情况下，M2-MΦ 对肿瘤浸润的量化更为明显。 M2-MΦ 表达高水平的与血管生成有关的基因，如血管生成因子 EGFL7 和肿瘤转移中的基因，如 LYVE1 和 NRP1，表明 M2-MΦ 浸润在肿瘤内血管生成中的作用。

髓样树突状细胞 (mDC) 将肿瘤抗原呈递给 T 细胞，在适应性抗肿瘤免疫反应的启动和调节中起关键作用。 分析确定了三个 mDC 亚群，每个亚群都高表达 CD1C、CLEC9A 或 LAMP3。 不同 mDCs 亚群的细胞丰度未观察到显著变化

总体而言，骨髓细胞的分析确定了可能导致肿瘤进展的免疫抑制亚群，包括 MDSC 样单核细胞 (TIMo) 和具有 M2 样特征的巨噬细胞。

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Prostate cancer is characterized by T-cell exhaustion and immunosuppressive Treg activity

适应性免疫系统在启动针对肿瘤的有效抗原特异性免疫反应方面发挥着关键作用。 lymphoid compartment的无监督聚类揭示了四个 CD4+ T 细胞、三个 CD8+ T 细胞和两个 NK 亚群，由关键标记基因注释。 使用细胞毒性基因特征（“细胞毒性评分”）测定 CD8+ T 细胞的功能状态。 与其他 CTL-1 和 CTL-2 CD8+ 亚群相比，CD8+ 效应细胞表现出更高的细胞毒性评分，并且 CD8+ 效应细胞的细胞毒性评分在不同样品组分中是一致的。

与健康前列腺组织相比，CTL-1 和 CD8+ 效应细胞都表现出更高的 T 细胞衰竭基因特征表达，并且前列腺肿瘤和 adj 正常样本中的衰竭评分更高。 在比较来自 LG 和 HG 样品的细胞时，没有观察到exhaustion score 的显著差异。 与健康前列腺组织相比，T 细胞丰度的测量显示从癌性前列腺收集的组织中耗尽的 CTL-1 细胞比例更高，这表明前列腺肿瘤中耗尽的 CTL 扩增。 比较 LG 和 HG Gleason 组时，T 细胞丰度未观察到差异。

根据细胞类型特异性基因，CD4+ T 细胞被细分为初始细胞、T-helper-1 (Th1)、T-helper-17 (Th17) 和 T-调节 (Treg) 细胞。 CD4+ 细胞丰度在不同样品组分中是稳定的。 作为 CD4+ T 细胞功能的替代物，检测了 Treg 活性并在肿瘤和 adj 正常样本中增加。 值得注意的是，肿瘤坏死因子受体超家族 TNFRSF9、TNFRSF18 和 TNFRSF4 的基因在浸润肿瘤的 Treg 中高度且唯一地表达。 这些受体结合肿瘤坏死因子、参与炎症相关癌变的促炎细胞因子和支持免疫抑制性 TME。

Tregs 和 MDSCs 代表了两种对癌症免疫耐受很重要的免疫抑制细胞群。 两个群体在肿瘤部分都表现出高抑制活性，并且它们的串扰先前已在不同的癌症中被报道过。 基于此，我们检查了肿瘤样本及其邻近正常组织样本中 TIMo 中的 MDSC 评分与 Treg 中的 Treg 活性评分之间的相关性。 在肿瘤分数中，MDSC 评分和 Treg 活性评分显著相关，LG 和 HG Gleason 患者之间没有明显的区别。 在 adj 正常组织中没有发现相关性。

总之，对前列腺肿瘤中 T 细胞亚群的功能状态进行了表征，以证明 CTL 耗尽以及 Treg 抑制活性增加，这与 MDSC 样单核细胞的抑制活性密切相关。

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The prostate cancer TME is enriched in exhausted CD56^DIM NK cells

自然杀伤 (NK) 细胞是一种先天性淋巴细胞，具有细胞毒性功能，可通过激活和抑制细胞表面受体进行调节。 高密度的肿瘤浸润 NK 细胞通常与不同实体瘤（包括乳腺癌、肺癌和前列腺癌）的良好预后相关。 NK 细胞基于关键标记基因表达进行注释，聚类揭示了 4 个 NK 亚群。 在 5 个不同的样品级分中没有观察到 NK 细胞丰度的差异。 NKT 细胞的特点是 T 细胞标记基因 CD3D 和 CD8 以及 CD56dim NK 细胞的高表达是由终末分化的 NK 细胞表达的 HAVCR2 的高表达。 CD56bright NK 细胞表达 XCL1、XCL2、GZMK、CD44 和 KLRC1，而 CD56bright-IL7R+ 细胞基于 IL7R 和归巢受体 SELL（编码 CD62L）的特异性表达而分离.

NKT和CD56^DIM细胞也表现出效应蛋白和细胞毒相关基因FGFBP2、GNLY、GZMB、GZMH的高表达。 然而，与健康组织相比，这些相同的 NK 亚群在肿瘤样本中表现出更高的衰竭基因特征，表明前列腺 TME 内的效应器功能受损。 在 NK 亚群中，与健康前列腺相比，CD56^DIM 细胞的衰竭基因特征得分最高，并且在前列腺肿瘤中的丰度更高.

The prostate cancer TME is characterized by activated B cells

与骨髓和 T 细胞对应物相比，B 细胞在癌症中的研究较少。 B 细胞浸润已在几种癌症类型中进行了描述，尽管它们的功能和与生存的相关性仍然存在争议。 基于关键标记基因的 B 细胞聚类揭示了 3 个亚群：幼稚 B、活性 B 和浆细胞。 五个样品部分的 B 细胞丰度相似。 在活性 B 细胞和浆细胞中评估 B 细胞活性。 与健康前列腺相比，来自肿瘤和辅助正常组织的细胞中的 B 细胞活性显著更高，这可能是由于 B 细胞识别肿瘤抗原所致。 然而，这种增加的活性伴随着肿瘤样本中较低的 B 细胞丰度。

In our spatial characterization of immune cells, B cells and macrophages were most abundant, with few monocytes, T cells and plasma cells. This low abundance did not permit a formal analysis of potential ligand/receptor interactions.

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Discussion

使用 bulk 转录组和基因组测序方法对局部前列腺癌进行了广泛研究，为致癌驱动因素和复发性分子变化提供了见解。 在这里，使用高分辨率单细胞方法来表征肿瘤微环境中肿瘤、免疫和非免疫基质细胞的变化。 这些发现得到了空间转录组分析的补充，其中组织结构和细胞间关系得以保留，从而可以确定转录组变化是否与环境有关。

研究的优势包括（a）患者样本的新鲜性质，（b）在一系列 Gleason 评分中匹配的肿瘤和邻近正常样本，以帮助克服固有的患者与患者之间的差异，（c）严格收集真正正常的对照前列腺样本（健康），和（d）组合的单细胞和空间转录组分析。事实上，使用 Slide-seqV2 来表征前列腺肿瘤组织的高度详细的空间转录组分析，以及一种新的计算方法来检测不同细胞类型中空间背景相关的转录差异，这些差异通常被来自的混合物所掩盖相邻的细胞。这种变化可能会提供关于微环境对细胞的影响以及可能诱导这种变化的机制的见解。

正如预期的那样，除了内皮细胞、成纤维细胞和周细胞的非免疫基质群外，前列腺 TME 与几个髓细胞亚群、T 细胞、NK 细胞和 B 细胞是复杂的。This led to some key observations.

关于上皮细胞，确定了在正常前列腺组织中描述的不同的hillock and club cells 亚群。 已在人类前列腺肿瘤中鉴定出club细胞； 我们的 RNA 速度分析表明了先前报道的club细胞的祖细胞作用。 还看到了从小丘到基底细胞的定向流动，表明小丘细胞的第二个祖细胞作用。 在我们的数据集中识别小丘上皮子集可能是由于我们遵循的解离方案，因为据报道，肿瘤解离的方法和条件会影响原发性实体瘤组织中的细胞产量和转录状态。 然而，在我们的 Slide-seq 数据中也检测到了小丘上皮细胞，其中没有发生解离。

恶性细胞和正常细胞很难区分。 这里使用了一种迭代策略，首先依靠检测基因组畸变来区分正常和恶性腔型细胞，然后推导出一个简洁的前列腺肿瘤基因特征，它可以在四个独立的数据集中可靠地识别肿瘤细胞

关于骨髓细胞，我们发现一群肿瘤炎性单核细胞具有免疫抑制性，具有高 MDSC 基因特征。 此外，M2 样巨噬细胞在肿瘤微环境中大量增加，这一发现在单细胞分析和免疫组织化学中是一致的。 据报道，M2-巨噬细胞与前列腺癌的生长和进展有关，它们作为实体瘤的治疗候选者已获得显著的重要性。

关于淋巴细胞，观察到细胞毒性 T 淋巴细胞显示出高耗竭特征以及低细胞毒性特征。 Treg 细胞也表现出高耗竭特征。 有趣的是，在比较low-grade and high-grade cases，没有看到显著的 T 细胞差异，这表明即使是low-grade肿瘤也已经建立了高度免疫抑制的微环境。 即使在 NK 细胞内，CD56^DIM NK 细胞也在肿瘤部分中扩增，再次表明功能上细胞毒性较低的 NK 细胞。

假设免疫抑制性骨髓细胞促成了耗尽的 T 细胞表型，正如我们小组之前在转移性前列腺癌的环境中所显示的那样。 事实上，MDSC 和 Treg 活性特征之间存在相关性，表明骨髓细胞在建立 T 细胞抑制和促肿瘤微环境中的作用。

利用空间邻域以高分辨率推断细胞间相互作用，这使得能够识别未解离组织切片中的配体-受体相互作用，尤其是肿瘤细胞与其基质之间的相互作用。 除了我们强调的肿瘤-成纤维细胞和肿瘤-内皮细胞通讯之外，我们希望这种分析将证明对社区更广泛有用，并指向临床相关和治疗靶向的相互作用。 该分析还支持将涉及组织解离的技术与保留正常组织结构以关注这些细胞-细胞关系的技术相辅相成。

总体而言，该原发性前列腺肿瘤样本及其正常对照的单细胞和空间转录组分析组合数据集提供了丰富的数据资源。 对肿瘤与其邻近免疫细胞和基质细胞的关系进行生物学验证，将有助于更好地了解前列腺癌的进展，并为这种常见疾病确定新的治疗靶点。 我们也希望这份手稿能强调多学科团队的重要性，因为只有在外科、病理学和基础科学拼贴真正合作时才能获得纵向收集的新鲜患者样本。

Method（关注一下重点方法）

Identification of tumor cells from luminal epithelial cells

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Spatial autocorrelation analysis

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Identification of significant ligand-receptor pairs

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