拟南芥转化技巧
Tips for arabidopsis transformation
拟南芥是一个神奇的模式生物，原因很多，其中最重要的是易于转化。产生转基因的动机有很多。拟南芥，从研究活植物中基因和蛋白质的转录和翻译动态，到补充突变表型。拟南芥适用于花滴或浸提转化法。
这种方法的一般步骤包括：
质粒的克隆与转化根癌农杆菌-一种将dna(Tdna)稳定整合到其攻击的植物基因组中的植物致病性物种。
转化农杆菌培养
在农杆菌培养中浸泡你的植物的花，以便将tDNA插入到植物的胚芽中
选择有tdna插入的种子(通常通过种子生长在含抗生素的培养基上)
性质上也有类似的过程；农杆菌TDNA插入可能促使甘薯驯化(肯特等人, 2015)!这听起来很简单，而且很简单，但是有一些技巧和技巧可以用来获得最佳的转换效率。它可能需要6-8周，从转化日期到有一个可分析的转基因手，所以这是非常重要的是，使这一过程是正确的，第一次。我会在这里列出一些指导方针。一个详细的转换协议，以及用于增长的协议。拟南芥也可获得(Weigel和Glazebrook，2002年).
选择表达系统
选择合适的表达载体是构建转基因拟南芥的第一步。有很多很好的选择，但这里有几个我最喜欢的选择。中川津司实验室的质粒是二进制网关向量并可用于启动子与荧光蛋白(YFP、GFP、CFP、RFP等)的启动子交换和N、C末端标记融合蛋白的生成。或关联标记(HA、标志)。此外，还有多种植物选择标记(BASTA、湿霉素、卡那霉素、衣霉素)。中川等人, 2007)。或者，如果你愿意金门总成，有一系列的丁尼实验室的质粒这还允许根据RFP在种子中的表达对转化子进行可视化选择(Emami，Yee和Dinneny，2013年).
植物转化准备
无论你正在转化成什么植物，都将是你的T0代。当这些植物开始开花时，它们就可以转化了。在花期开始后不久进行转化是很重要的。如果你的植物开始开花之前，你的构造准备转化，你可以切断初级花序(植物的开花部分)附近的茎基部。这给你买了几天，直到新的花序开始增长。这也将增加花序总数，这可能提高转化效率。如果你看到许多成熟的角果(种子荚)，你的植物可能太老，无法转化。这种转换仍然有效，但效率将很低。
小贴士：
使用健康的植物：你的植物不应该表现出压力的迹象，如花青素的产生，或疾病，如真菌的生长。健康的植物产生大量的种子。更多的种子意味着更多的机会来恢复一个转型。
使用年轻的植物：如果你早早地转化，你的植物在你把花暴露在花丛中之后，还会有足够的时间生产种子。农杆菌。更多的种子意味着更多的机会来恢复一个转型。
使用大量的植物：许多植物产生大量的种子。我通常使用8-10个植物的每一个构造我转换。更多的种子意味着更多的机会来恢复一个转型。
在转化前去掉成熟的角质：在转化前成熟的纤毛虫充满了你知道不会携带转基因的种子。您可以选择删除它们，以减少您以后要从池中选择的未转换种子的数量。
这个拟南芥转化过程
这个过程本身很简单。当你的农业细菌培养做好准备后，将它们向下旋转，并将它们重新悬挂在转化介质中。如果你在浸泡你的植物，把培养放进一个足够宽的容器里，把你的植物的花浸在里面。50毫升的猎鹰管或塑料称重船都是很好的选择，这取决于你选择使用的养殖量。你会得到农杆菌整个手套，所以一定要更换手套之间的结构，如果您正在转换多个结构在一次。
有关详细协议、体积、自旋速度、配方和农杆菌菌株见Weigel和Glazebrook，2002年.
小贴士：
做菌落PCR你的农杆菌：得到一个转化需要很长的时间。确保你正在培养的农用细菌一定含有你的质粒。
长出许多农杆菌：：你接触到的农杆菌越多，你就越有可能得到一种转化剂。我喜欢把100 mL的培养物降下来，然后再悬浮在25 mL的转化培养基中。农杆菌应变。此外，转换过程可能会变得有点混乱，所以您需要确保您有足够的体积来浸您所有的植物。
确保你的农杆菌文化并没有过度饱和：农杆菌需要活着才能感染你的植物。如果你的培养物在静止期被孵化了太长时间，你的培养中的细胞将不再是可行的。这将需要的时间将取决于您正在使用的培养量，以及您是从冷冻砧木或菌落从LB板接种。在我的手中，接种在平板上的菌落的5mL发酵剂培养将在18-24小时内达到最佳密度。然后，我在100 mL新鲜培养基中加入0.5 mL这种发酵剂，然后再用24小时进行转化。剩余的发酵剂可用于菌落PCR和甘油砧木。
浸泡/滴灌植物不止一次：浸泡你的植物，让它们恢复一周，然后再浸泡它们。这不会伤害他们，也会增加tDNA整合的机会。
选材拟南芥转化
一旦你的种子从你的T0植物是干燥的，是时候选择转化。从每一次转化中选择多个T1植株是非常重要的。我喜欢隔离至少五个人。您无法控制发生了多少次插入。有太多的插入会导致过度表达的工件，这样的结构很可能会在以后的几代中被沉默。您将知道，如果您获得了一个转换单插入，因为它将分离3：1在T2代。您也无法控制您的构造将被插入的位置。如果您的插入发生在编码区域，它可能会导致意外的表型。对于大多数表型分析，开始在T2代工作是合适的。选择过程本身会影响抗病植物的生长，所以你会想知道在没有选择的情况下插入的效果。
小贴士：
在选择过程中不要过于密集地制种：这将增加非转化者的背景生长，并使寻找真正的转化者更加困难。
不要把你的植物放在选择板上太久：即使是抗性植物最终也会受到选择的影响。
基因型假定的T1转化人：当你的T1在土壤上，并已从选择的压力恢复，你可以剪辑一片叶子，并提取基因组DNA进行基因分型。这不会伤害你的植物，在T1比T2更容易基因型。你的转基因不应该分离在T1，但它可能会在T2。
References
1. Emami, S., Yee, M. and Dinneny, J. R. (2013) ‘A robust family of Golden Gate Agrobacterium vectors for plant synthetic biology’, Frontiers in Plant Science, 4. doi: 10.3389/fpls.2013.00339. PubMed PMID: 24032037. PubMed Central PMCID: PMC3759027.
2 Harrison, S. J. et al. (2006) ‘A rapid and robust method of identifying transformed Arabidopsis thaliana seedlings following floral dip transformation’, Plant Methods. BioMed Central, 2(1), p. 19. doi: 10.1186/1746-4811-2-19. PubMed PMID: 17087829. PubMed Central PMCID: PMC1636043.
3. Kyndt, T. et al. (2015) ‘The genome of cultivated sweet potato contains Agrobacterium T-DNAs with expressed genes: An example of a naturally transgenic food crop.’, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. National Academy of Sciences, 112(18), pp. 5844–9. doi: 10.1073/pnas.1419685112. PubMed PMID: 25902487. PubMed Central PMCID: PMC4426443.
4. Nakagawa, T. et al. (2007) ‘Improved Gateway Binary Vectors: High-Performance Vectors for Creation of Fusion Constructs in Transgenic Analysis of Plants’, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71(8), pp. 2095–2100. doi: 10.1271/bbb.70216. PubMed PMID: 17690442.
5. Weigel, D. and Glazebrook, J. (2002) Arabidopsis : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Available at: https://books.google.at/books/about/Arabidopsis.html?id=IfZAMNPWVk4C&redir_esc=y (Accessed: 21 September 2018).
Additional resources on the Addgene blog
Engineering the plant genome using CRISPR/Cas9
Using pSiM24 for simplifying plant genetic engineering
Using arabidopsis in the classroom
Resources on Addgene.org
Find plant plasmids
Visit our plant resource page
Deposit arabidopsis plasmids with Addgene
