Illumina测序原理3-图解边合成边测序（Sequencin
2020-07-26 本文已影响0人
pythonic生物人
本文介绍Illumina平台边合成边测序原理、过程，数据拆分。
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本文将学到什么？？
1 测序原理
1）4通道SBS原理
2）2通道SBS原理
2 测序过程
杂交Read 1 引物
正义链测序
index1测序
去掉成簇时所阻断的3'端
index2测序
桥式扩增反义链
正义链被切除
反义链测序
3 数据分析
1 测序原理
即边合成边测序（Sequencing by Synthesis，SBS），过程如下图（不同平台dNTP荧光基团有差异，分4通道和2通道，过程类似，3步完成）：
- dNTP连接
- 扫描照相
- 叠氮基和标记的荧光基团切除
4通道SBS原理
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在聚合酶的作用下，某一种dNTP会结合到链上，叠氮基的存在使得一次只能连接一种dNTP；这时用水将剩余的dNTP和酶给冲掉，将Flow cell进行扫描，所得荧光对应的碱基即是该位置的碱基；同时在该Flow cell上有成千上万个cluster也在进行同样的反应，一个循环就能同时检测多个样本（这也是高通量的核心所在）。这个循环完成后，加入化学试剂把叠氮基和标记的荧光基团切掉，进行下一个循环（碱基的连接、扫描照相与切除）。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出，也就是Read1 序列。
以下简单介绍2通道和4通道边合成边测序差异:
2通道SBS原理
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2 测序过程
杂交Read1 引物
将Read1测序引物，四种dNTP（ATGC）和DNA聚合酶加入流动槽，测序引物与adapter中的互补引物杂交；dNTP特点：
- 被荧光基团标记，每种碱基标记的荧光基团不一样（具有独特的荧光波长，会发出不同颜色）；
- dNTP 3’末端连了一个叠氮基，这个叠氮基能够阻断后面的碱基与它相连，一次只能连接一个dNTP。
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正义链测序
测序
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洗脱测序生成的片段被变性洗脱掉，正义链测序完成
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index1测序
测序：index1 primer与链上index primer1 结合位点杂交配对，进行index1的合成及检测。
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洗脱：测序生成的index1片段被变性洗脱掉，index1测序完成
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去掉成簇时所阻断的3'端
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index2测序
测序
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洗脱
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桥式扩增反义链
扩增：以Flow cell上的P5 互补链为引物，Forward strand为模板进行桥式扩增，得到双链
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双链变性
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正义链被切除
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反义链测序
类似正义链测序，至此测序步骤结束
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3 数据分析
根据index获得每个样本的fastq格式测序数据或者bcl格式（Nextseq500下机数据为bcl格式），步骤如下：
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参考资料
https://www.bilibili.com/video/BV15s411t7SJ
https://www.bilibili.com/video/BV1ht411q7Whhttps://www.illumina.com.cn/
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