甲基化测序 -- 重亚硫酸盐法和TAPS两种方法

DNA甲基化，即在不改变碱基类型和DNA序列的前提下，在某些碱基上加上甲基的过程。它属于表观遗传学范畴，主要通过影响基因表达而改变生物体的性状。基因甲基化的结果，一般是使甲基化位点下游的基因表达量减少。今天在这里主要总结一下应用在测序中的甲基化检测方法：重亚硫酸盐法和TAP法。

1. 重亚硫酸盐法

文章链接🔗 A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.

1.1 检测原理

原理：重亚硫酸盐能够将C碱基转化成U碱基，而甲基化修饰后的C碱基不会和重亚硫酸盐发生反应，能够在重亚硫酸盐处理中，一直保持C碱基的状态。因此在对测序数据的比对中，但凡检测到的C碱基均表明该位置的C为甲基化修饰过的C。

1.2 两种建库方法

• Illumina 公司的 Truseq DNA建库方法 （先建库，后转化）
  也就是说，待检测的DNA样品首先要按照正常的建库流程：打断获得DNA片段（200bp左右）--> DNA末端修复并加入ploy A尾 --> 加入接头

  
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Illumina Truseq DNA建库试剂盒当中，它所提供的接头都已经经过甲基化修饰了，因此可以保证接头上的C还是保持C，不会被转化成U，从而保证它可以和固定在flowcell上的DNA接头互补杂交，通过发生桥式PCR反应、成簇进行测序。

这种方法最大的缺点：构建好的文库使用重亚硫酸盐处理时，90%以上的DNA链会断掉（伤敌一千自损八百）。因此文库的丰富度会损失90%以上，同时便要求样品量足够高。
这种方法的好处：建库过程中用的PCR循环数较少，所以它PCR扩增效率不同，引起的文库不均一程度较低，也就是PCR偏好性低。

• EpiGnome 方法
  1.重亚硫酸盐先处理DNA，把未甲基化的C都转变成U
  。。。
  优点：把重亚硫酸盐处理的过程放在了建库前，这样建成的库的丰富程度会比较高。
  缺点：要做较多的PCR循环，这样PCR产物的扩增均一性不是太好，PCR偏性较大。

Hiseq 2000 /2500 测甲基化文库的问题和解决方案
对于Illumina的HiSeq2000或者2500平台上进行测序，如果文库是 碱基平衡 的文库（也就是A/C/G/T四种碱基的比例各占25%左右的文库），测序仪对碱基的判读会比较好。
而甲基化的C毕竟占比不高，这种将正常C转化成U的方法无疑使最终上机的DNA文库碱基不平衡，这样在使用Hiseq 2000 /2500测序仪来测甲基化文库的过程中，文库测序得到的数据质量就很差，并且经过过滤得到的有效数据质量也会较低。实际上机过程中，为了弥补甲基化文库的碱基不平衡，通常会掺入大比例（一般为30%）的基因组文库、或者PhiX文库，来补充较多的C碱基。

• 设置内参
  由于重亚硫酸盐对未甲基化的C的转化效率不是100%（一般99%左右），为了对实验的转化效率进行控制。一般会在转化实验中加入1%内参对照品：λDNA(甲基化酶缺陷型的大肠杆菌所生产出来的完全没有甲基化的DNA) 或 pUC19 DNA(质粒)来看转化效率。（同样可以通过用甲基化酶处理过的,CpG岛完全被甲基化的DNA）来追踪甲基化DNA对重亚硫酸盐转化的抵抗效果。

• 数据分析（需要做两次转换）
  测序出来的序列在和基因组进行对比时，直接对比是比对不上的。
  -- 把 参考基因组 上所有的C都改成T，和测序序列进行对比
  -- 把 参考基因组 上所有的G都改成A，和测序序列进行对比

比对上之后，再寻找reads中的C碱基，标记他们的坐标，这些便是我们寻找的甲基化的C碱基。

TAPS甲基化测序

TAPS 英文全称 "TET-assisted pyridine borane sequencing"，TET协助的吡啶硼烷测序。TET(ten-eleven translocation)指的是“10-11转位酶”，TET酶能够把甲基化的C碱基转化成羧基化的C碱基。原理：接着在吡啶硼烷作用下把羧基化的C转化成二氢尿嘧啶（也就是多两个H原子的U碱基），二氢尿嘧啶在PCR和测序过程当中，都会识别成T。
可以通过对比转化前后哪些C碱基被转化成了T，就可以知道哪些C是被甲基化了的。
TAPS的假阴性率 2.7%-3.5%，假阳性率0.23%
优点：

• TAPS方法对DNA的破坏很小，可以保持10KB以上的长链DNA。
• 只要1ng的DNA量就能建库，相比重亚硫酸氢盐的方法少了一千倍（1ug DNA）
• TAPS得到的DNA文库复杂度高（仅把占比很小的甲基化C进行了改变，对DNA的天然序列改变很小，碱基平衡），对Illumina测序仪更加友好，数据质量较高，有效数据量增加
• 可以使用通用的BWA序列比对方法完成序列比对工作（重亚硫酸盐法得到的数据，因为大量的C碱基都被改成了T，所以要用特殊的软件来分析，例如Bismark软件）
  文章🔗 Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution