ATAC-seq专题---生信分析流程
ATAC-seq信息分析流程主要分为以下几个部分：数据质控、序列比对、峰检测、motif分析、峰注释、富集分析，下面将对各部分内容进行展开讲解。
一、测序数据过滤与质量评估
下机数据经过过滤去除接头含量过高或低质量的reads，得到clean reads用于后续分析。常见的trim软件有Trimmomatic、Skewer、fastp等。fastp是一款比较新的软件，使用时可以用--adapter_sequence/--adapter_sequence_r2参数传入接头序列，也可以不填这两个参数，软件会自动识别接头并进行剪切。如：
fastp \
--in1 A1_1.fq.gz \ # read1原始fq文件
--out1 A1_clean_1.fq.gz \ # read1过滤后输出的fq文件
--in2 A1_2.fq.gz \ # read2原始fq文件
--out2 A1_clean_2.fq.gz \ # read2过滤后输出的fq文件
--cut_tail \ #从3’端向5’端滑窗，如果窗口内碱基的平均质量值小于设定阈值，则剪切
--cut_tail_window_size=1 \ #窗口大小
--cut_tail_mean_quality=30 \ #cut_tail参数对应的平均质量阈值
--average_qual=30 \ #如果一条read的碱基平均质量值小于该值即会被舍弃
--length_required=20 \ #经过剪切后的reads长度如果小于该值会被舍弃
fastp软件的详细使用方法可参考：https://github.com/OpenGene/fastp。fastp软件对于trim结果会生成网页版的报告，可参考官网示例http://opengene.org/fastp/fastp.html和http://opengene.org/fastp/fastp.json，也可以用FastQC软件对trim前后的数据质量进行评估，FastQC软件会对单端的数据给出结果，如果是PE测序需要分别运行两次来评估read1和read2的数据质量。
如：
fastqc A1_1.fq.gz
fastqc A1_2.fq.gz
FastQC会对reads从碱基质量、接头含量、N含量、高重复序列等多个方面对reads质量进行评估，生成详细的网页版报告，可参考官网示例：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/good_sequence_short_fastqc.html
二、序列比对
经过trim得到的reads可以使用BWA、bowtie2等软件进行比对。首先需要确定参考基因组fa文件，对fa文件建立索引。不同的软件有各自建立索引的命令，BWA软件可以参考如下方式建立索引：
bwa index genome.fa
建立好索引后即可开始比对，ATAC-seq推荐使用mem算法，输出文件经samtools排序输出bam：
bwa mem genome.fa A1_clean_1.fq.gz A1_clean_2.fq.gz
| samtools sort -O bam -T A1 > A1.bam
值得注意的是，在实验过程中质体并不能完全去除，因此会有部分reads比对到质体序列上，需要去除比对到质体上的序列，去除质体序列可以通过samtools提取，具体方法如下：首先将不含质体的染色体名称写到一个chrlist文件中，一条染色体的名称写成一行，然后执行如下命令即可得到去除质体的bam
samtools view -b A1.bam $chrlist > A1.del_MT_PT.bam
用于后续分析的reads需要时唯一比对且去重复的，bwa比对结果可以通过MAPQ值来提取唯一比对reads，可以用picard、sambamba等软件去除dup，最终得到唯一比对且去重复的bam文件。
三、reads在染色体上分布的可视化
比对后得到的bam文件可以转化为bigWig（bw）格式，通过可视化软件进行展示。deeptools软件可以实现bw格式转化和可视化展示。首先需要在linux环境中安装deeptools软件，可以用以下命令实现bam向bw格式的转换：
bamCoverage -b A1.bam -o A1.bw
此外，可以使用deeptools软件展示reads在特定区域的分布，如：
computeMatrix reference-point \ # reference-pioint表示计算一个参照点附近的reads分布，与之相对的是scale-regions，计算一个区域附近的reads分布
--referencePoint TSS \#以输入的bed文件的起始位置作为参照点
-S A1.bw \ #可以是一个或多个bw文件
-R gene.bed \ #基因组位置文件
-b 3000 \ #计算边界为参考点上游3000bp
-a 3000 \ #计算边界为参考点下游3000bp，与-b合起来就是绘制参考点上下游3000bp以内的reads分布
-o A1.matrix.mat.gz \ #输出作图数据名称
#图形绘制
plotHeatmap \
-m new_A1.matrix.mat.gz \ #上一步生成的作图数据
-out A1.pdf \ # 输出图片名称
绘图结果展示：
reads在TSS附近的分布
四、Peak calling
MACS2能够检测DNA片断的富集区域，是ATAC-seq数据call peak的主流软件。峰检出的原理如下：首先将所有的reads都向3'方向延伸插入片段长度，然后将基因组进行滑窗，计算该窗口的dynamic λ，λ的计算公式为：λlocal = λBG（λBG是指背景区域上的reads数目），然后利用泊松分布模型的公式计算该窗口的显著性P值，最后对每一个窗口的显著性P值进行FDR校正。默认校正后的P值（即qvalue）小于或者等于0.05的区域为peak区域。需要现在linux环境中安装macs2软件，然后执行以下命令：
macs2 callpeak \
-t A1.uni.dedup.bam \ #bam文件
-n A1 \ # 输出文件前缀名
--shift -100 \ #extsize的一半乘以-1
--extsize 200 \ #一般是核小体大小
--call-summits #检测峰顶信息
注：以上参数参考文献（Jie Wang，et.al.2018.“ATAC-Seq analysis reveals a widespread decrease of chromatin accessibility in age-related macular degeneration.”Nature Communications）
五、motif分析
ATAC分析得到的peak是染色质上的开放区域，这些染色质开放区域常常预示着转录因子的结合，因此对peak区域进行motif分析很有意义。常见的motif分析软件有homer和MEME。以homer软件为例，首先在linux环境中安装homer，然后用以下命令进行motif分析：
findMotifsGenome.pl \
A1_peaks.bed \ #用于进行motif分析的bed文件
genome.fa \ #参考基因组fa文件
A1 \ #输出文件前缀
-size given \ #使用给定的bed区域位置进行分析，如果填-size -100,50则是用给定bed中间位置的上游100bp到下游50bp的区域进行分析
homer分析motif的原理及结果参见：http://homer.ucsd.edu/homer/motif/index.html
根据motif与已知转录因子的富集情况可以绘制气泡图，从而可以看到样本与已知转录因子的富集显著性。
六、差异分析
差异peak代表着比较组合染色质开放性有差异的位点，ChIP-seq和ATAC-seq都可以用DiffBind进行差异分析。DiffBind通过可以通过bam文件和peak的bed文件计算出peak区域标准化的readcount，可以选择edgeR、DESeq2等模型进行差异分析。
七、峰注释
在科研分析中我们往往需要将peak区域与基因联系起来，也就是通过对peak进行注释找到peak相关基因。常见的peak注释软件有ChIPseeker、homer、PeakAnnotator等。以ChIPseeker为例，需要在R中安装ChIPseeker包和GenomicFeatures包，然后就可以进行分析了。
library(ChIPseeker)
library(GenomicFeatures)
txdb<- makeTxDbFromGFF(‘gene.gtf’)#生成txdb对象，如果研究物种没有已知的TxDb,可以用GenomicFeatures中的函数生成
peakfile <-readPeakFile(‘A1_peaks.narrowPeak’)#导入需要注释的peak文件
peakAnno <- annotatePeak(peakfile,tssRegion=c(-2000, 2000), TxDb=txdb)
# 用peak文件和txdb进行peak注释，这里可以通过tssRegion定义TSS区域的区间
对于peak注释的结果，也可以进行可视化展示，如：
p <- plotAnnoPie(peakAnno)
八、富集分析
通过注释得到的peak相关基因可以使用goseq、topGO等R包进行GO富集分析，用kobas进行kegg富集分析，也可以使用DAVID在线工具来完成富集分析。可以通过挑选感兴趣的GO term或pathway进一步筛选候选基因。
