5. Q-PCR总结

2020-03-20  本文已影响0人  灰毛老虎

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR的优势

实时荧光定量PCR技术解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

1）Ct值的重现性：PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值与起始模板的线性关系：由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

Ct值（Cycle threshold，循环阈值）：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数

  1. 荧光阈值（threshold）的设定
    PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15
  2. Ct值与起始模板的关系
    每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式为：Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
    1. n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
    2. 起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

Q-PCR检测方法

  1. SYBRGreenⅠ法：
    在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

  2. TaqMan荧光探针法：
    PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

  3. 分子信标法：
    是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。

传统定量PCR

1．传统定量PCR方法简介

1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

3）PCR-ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR-ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

2．内标在传统定量中的作用

由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

3．内标对定量PCR的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。

Q-PCR 实验流程

  1. Trizol法提RNA

以最基本的基因表达差异分析为例，实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。组内要有复孔，要有生物重复，这样可以统计分析此处理是否有统计学意义。

  1. 去基因组

  2. mRNA逆转录为cDNA

  3. 定量PCR检测

    1. 引物设计
      1. 登录NCBI找到目标基因的geneID
      2. 进入primer bank，通过选择geneID和物种找到已经设计好的引物

      3. primer blast进行引物特异性的验证


    2. 引物测试
      1. 根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。
      2. 得到结果后， 首先根据熔解曲线判断引物特异性， 选择标准为： 单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct 值小、扩增效率高的引物进行正式实验。
        3．一个样品的加样尽可能安排在同一行
    3. 正式实验
    4. 上机
    5. 差异表达计算（2‐ΔΔCt法）：这是最常用的进行相对基因表达分析的方法，得到的结果是实验组中目的基因相对于对照组中目的基因表达的差异倍数。要求目的基因和内参基因的扩增效率都接近 100%，且相对偏差不超过 5%。计算公式如下：
      1. 首先用内参基因的 Ct 值对实验组(test)和对照组 (con)的靶基因 Ct 值进行归一化：
        ΔCttest=实验组目的基因 Ct 值-实验组内参基因 Ct 值
        ΔCtcon=实验组目的基因 Ct 值-实验组内参基因 Ct 值
      2. 随后用对照组的Ct值归一实验组的ΔCt：
        ΔΔCt=ΔCttest-ΔCtcon
      3. 最后计算表达水平的差异倍数：
        Change Fold=2‐ΔΔCt

内参基因的选择

  1. 内参基因的作用就是去除不同样本在RNA产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别，从而获得目的基因特异性表达的真正差异。所以，选择内参基因进行校正和标准化。通常选择内参基因的标准是：

    1. 高度或中度表达，排除太高或者太低
    2. 表达水平不受任何外源性因素等影响
    3. 不存在假基因

  2. 没有一种RNA的表达水平在所有条件下是恒定的，在各种因素的影响下，如细胞周期的不同阶段，内参基因的RNA表达水平是变化的。故我们研究者应该根据自己所研究的细胞和组织类型以及实验要求，做预实验。从多种内参基因中筛选出适合自己实验的稳定表达的内参基因。同时也可以选择多内参基因的研究方法，设置两个或两个以上内参基因，取平均值，然后去校正自己的目的基因能够得到更可靠的结果。

GAPDH

  1. 为什么GAPDH被选作内参基因？

GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶，经典的糖酵解反应中的一个酶。该酶广泛存在于众多生物体中，并且在细胞中含量丰富，占总蛋白的10%-20%。GAPDH基因有高度保守的序列，在同种细胞或者组织中的蛋白表达量一般是恒定的。故长期以来该基因被广泛用作qPCR或Western blot中的内参基因。

  1. GAPDH不适合选作内参的情况：

GAPDH基因是糖酵解中的关键基因，在代谢中过程中的表达很容易受到多种因素的影响。如在细胞的增殖过程中，细胞需要的能量ATP增多，糖酵解代谢加大，GAPDH基因的表达水平很有可能被上调。该基因可作为肿瘤发生的标志物，在肿瘤组织与正常细胞及癌旁正常组织比较时，GAPDH表达并不一致。故在比较肿瘤组织与正常组织或细胞的某种基因或蛋白的表达时，GAPDH作为内参应慎重。

β-actin

  1. 为什么β-actin被选作内参基因？

β-actin选作内参基因因其序列高度保守，其mRNA表达数量高，是横纹肌肌纤维中的一种主要的蛋白成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。该基因几乎在所有真核细胞中表达，广泛存在哺乳动物动物的组织与细胞内。故作为内参基因是得到公认的。

  1. β-actin不适合选作内参的情况：

对于actin蛋白由几种异构体组成，actin大致可以分为6种，存在于组织分布特异性，不同actin之间具有较大的序列相似性(>90%)。在肌肉组织中β-actin分布很少，心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的组织都适合选β-actin作为内参。例如当细胞向恶性转化时，β-actin mRNA的表达水平增加；而假基因的的存在也可干扰β-actin的检测，此时并不适合选择β-actin作为内参。

18S rRNA

  1. 为什么18S rRNA被选作内参基因？

18S rRNA与30多种核糖体蛋白共同构成真核生物核糖体40S小亚基，从而与60S大亚基一起完成细胞中的蛋白质合成。18S rRNA作为内参的原因可总结如下：
1. 18S rRNA存在于核糖体小亚基中，其编码基因rDNA（18S rRNA/rDNA）在生物演化过程中相当保守
2. 存在于所有真核生物细胞中
3. 易于使用通用引物扩增
4. rRNA的合成是由RNA聚合酶I合成，mRNA是由RNA聚合酶II合成，因此rRNA合成的调节独立于mRNA，在影响mRNA表达的各种条件下，各种rRNA水平很少发生变化
5. rRNA属于高峰度表达，远远高于目标mRNA，较其他内参基因稳定且受RNA降解影响较小。故18S rRNA被广泛选作内参。

同样是rRNA的5S rRNA和5.8S rRNA以及28S rRNA就不适合作为内参，因为5S与5.8S在核糖体大亚基中的rRNA分子序列短，提供的信息少，28S rRNA序列虽然较长，可提供更多的信息，能更准确地揭示系统发育的规律，但基因数据库中相关信息较少，不利于比较分析。

  1. 18S rRNA不适合选作内参的情况

rRNA的转录易受到各种生物因素和药物的影响。在有丝分裂期间，28S、18S rRNA明显减少或停止表达。此外存在很大争议的是rRNA没有poly(A)尾，在以oligo(dT)为引物的cDNA合成中不能被逆转录，建议在反转录的过程中除用oligo(dT)引物外，还要用18S作为反向引物，反转录后的cDNA最好用RNA酶处理一下，再高温灭活。

其他内参基因的表达情况

其实不仅仅是GAPDH和β-actin或18S rRNA这三个基因在作为内参基因的存在问题，其他的很多内参基因在不同组织中的表达水平也是存在较大差异的。如不同内参基因在不同组织中表达波动较大的HPRT基因△CT为10.3；同一内参基因在不同的组织中，如心，脑，胎盘，肺，肝，骨骼肌，肾等组织中表达也不是恒定的。

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