单细胞测序注意事项必读

1. 组织样本经过解离变成细胞悬液，失去了空间位置信息，需要联合空间转录组等技术定位位置信息；

2. 组织样本经过组织保存、运输、酶解、裂红、去死等一系列实验操作，细胞中基因表达受到外界环境的应激反应偏离原来状态；

3. 不同细胞类型在组织消化过程中解离下来的难易程度不一，单细胞测序分析得到的细胞类型占比未必反应出实际占比，甚至有些细胞无法被解离消化下来或者细胞过于脆弱在解离和捕获实验中发生死亡；例如肝脏组织肝实质细胞以及血液中的粒细胞；

4. 不同实验批次的样本、解离方法和实验操作的差异引起的批次效应，与个体异质性带来的差异难以区分，依赖于人为主观经验判断是否需要去除批次，去除批次的方法选择因人而异，服务公司经常选择固定CCA或者MNN等常规方法；

5. 不同组织类型的样本、不同病理状态的样本、不同个人来源的样本，不同取样位置的样本，在相同的消化条件效果差异较大，往往解离活性低的样本不会选择上机，因此成功上机的样本都是经过活性标准的筛选，最终得到的结果存在幸存者偏差；

6. 经过组织酶解消化产生的细胞碎片和游离RNA产生严重的背景干扰，虽然通过去死、离心和流式分选等方法降低背景噪音，但增加较为繁琐的实验操作，是否有更为简单的去处背景噪音的办法；

7. 针对少量珍贵细胞样本(比如穿刺样本，数千个细胞），在目前的微流控和微孔板技术平台需要承担较大失败风险直接上机，并且细胞捕获效率基本在30~60%，是否有更高细胞捕获效率的方法；

8. 高通量单细胞测序检测到3`端转录本，只有基因表达定量信息，无法得到基因结构变异信息；可以通过三代全长建库测序的方法解决可变剪切和融合基因的分析。

9. 高通量单细胞测序在基因检测灵敏度较低，只能检测细胞表达全部基因的top 10%~30%，表达丰度低的基因无法检出，并且在不同细胞中存在gene dropout现象，可能会出现你所关注的目标基因几乎没有检出的问题；基因检出效率理论上越高越好，落实到具体的研究中满足自己的研究目的即可；

10. 单细胞测序数据解析最终还是落实到细胞群或者亚群的分析层面上，因此得到的基因表达矩阵经过降维聚类进行细胞分群，根据基因表达经典marker以及signature gene set推断出细胞类型和细胞亚型，细胞大类的经典marker相对特异，还有一些细胞类型没有特异性的marker， 例如髓系中marophage/monocyte/DCs等细胞类型区分，T和NK之间区分，无法依赖某一个经典marker gene，就依赖于signature gene set（特征基因集）, 但特征基因集在不同组织类型中各异，没有统一的标准，例如T细胞的亚群，分群层次和分群属性没有定论，不同研究根据研究目的需要自行决定；期待将来能够有完善权威的细胞图谱，给出更全面的细胞类型和细胞状态的图谱数据，并制定出科学普适的细胞分类标准；

11. 单细胞单一组学数据在某些细胞异质性解析和机制阐述方面也有无能为力的时候，可以选择结合上下游组学技术如蛋白、表观遗传等其他组学技术进行多组学联合；

12. 目前单细胞捕获的技术有较高比例的多细胞捕获问题，捕获1万个细胞，甚至能达到10%以上的多细胞捕获率，必须结合软件和手动鉴定的方式同时去除

13. 技术平台由于孔径限制对于细胞尺径大小有要求，一般要求在40um以下，对于肌肉细胞、脂肪细胞、神经元细胞等较大尺径细胞无法直接捕获，可以通过抽提细胞核的方法进行单细胞研究；

14. 单细胞测序数据的标准分析内容只是半成品，必须经过细胞类型鉴定、细胞状态判定、轨迹推断和通路富集等一系列探索性、个性化以及反复调整的数据挖掘过程，才有可能得到符合实验目的的新发现；而且在这个数据挖掘过程中非常依赖经验积累养成的主观判断、不断阅读学习文献和不懈的探索深入；

15. 涉及单细胞方案一定要提前做好文献调研工作，提前了解所要研究的样本类型的细胞组成，目标研究细胞类型是什么？目标细胞的数量占比多少？目标细胞是否需要富集，选择哪种方法富集，用何种方法解离，如何设计对照和比较组别，样本量多少合适，用何种单细胞平台技术，需要测多少数据量等等问题；