流式（骨髓） 2019.5.17

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取骨髓细胞

1. 实验准备

   1.1 器材   杀鼠板，手术器械，酒精喷壶；5cm dish；研钵；
             15mL离心管(管壁做好标记），离心管架；1mL枪，蓝枪头；
   1.2 试剂   PBS

   1.3# 若细胞需要培养或分选，需在原代细胞间中操作
   * 实验前将小鼠和手术器械浸泡于酒精中
   * 其他器材喷酒精并紫外照射30min

2. 取骨头

   2.1 脱颈处死小鼠
        注意点： 体表喷足酒精，尽量防止毛沾到组织上 
   2.2 暴露股骨、胫骨、髂骨
   2.3 掰取骨头
        技巧： 沿关节活动的反向用力
   2.4 剥离肌肉
   2.5 去除关节   

3. 取骨髓细胞

   3.1 清洗骨头：在6cm dish中倒入PBS，洗去骨头表面的血液、肌肉细胞
   3.2 研磨骨头：在研钵中压碎骨头
        技巧：  借助研磨棒左右摆动来碾压骨头。
        注意点： 长骨的造血部位位于两端，应将其充分压碎，以便尽可能收集骨髓细胞。
   3.3 冲洗骨粉：3~4mL的PBS（视骨头的量而定）冲洗，收集细胞悬液至15mL离心管中；共重复两次
        注意点： 加入PBS后用移液枪冲洗数次，直到骨渣变白，其中不再有血细胞。

   3.4 离心1400rpm，5min，弃上清   
        注意点：配平用同一型号的离心管
        此时可收拾台面：
            将小鼠尸体封袋弃于冰箱，垫料倒垃圾桶，冲洗鼠笼并晾置；
            将用过的5cm dish丢弃；未使用的放回；
            将离心管架、PBS、枪、枪头放回，台面喷酒精后擦干净；
            将杀鼠板、研钵、手术器械洗净，杀鼠板晾置，研钵和手术器械放烘箱15min
   3.5 用1mLPBS重悬细胞

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染色

1. 实验准备

    1.1 确定配色    
    CD3--FITC（T细胞）  B220--PC7（B细胞）    CD11b--PE（髓系） Gr-1--APC-A750（中性粒） DAPI--PB450（死细胞）
    由于CD3阳性细胞较少，可用CD11b--FITC调FITC的补偿
    1.2 器材  流式管(blank+单标+样品，做好标记); 
             2ul枪，200ul枪，1000ul枪，白、黄、蓝枪头；
             冰盒；孵育盒
    1.3  试剂 PBS；流式抗体；细胞悬液

2. 加细胞悬液

    向每支流式管中加入50ul细胞悬液。

3. 染单标管

    3.1 每管加入0.5ul抗体。
        注意点：加入抗体时枪头应伸入液面以下；吹匀但不要吹出气泡，不要吹到管壁上
               抗体的量需要根据目的细胞量来决定，通常染色细胞数为收集细胞数的10倍。
               一般需要先记录总数，再根据目的细胞群体数目比例的不同来圈门，然后来决定进行染色的细胞总数。
        技巧： 可以用枪头将溶液搅匀，并将流式管底部轻磕桌面以震荡均匀

4. 染样品管

    4.1 制作 master mix：（20ul PBS + 每种抗体各0.5ul）*样品管数  在EP管中混合均匀
    4.2 向各样品管中加入20ul混合液。

5. 避光孵育

    5.1 避光4℃孵育20min以上（30min）。
    5.2 每管加入1ml的PBS以终止反应。
    5.3 离心1400rpm,5min，弃上清。
        此时可以将抗体放回冰箱，并准备流式上机所需材料。
    5.4 每管加入250ul的PBS重悬。

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上机

1. 实验准备

    1.1 器材  流式管架，400目滤膜，孵育盒，1000ul枪，2ul枪，蓝、白枪头
    1.2 试剂  DAPI，已染色的细胞悬液
    1.3 开机流程    dd水高速8分钟
    1.4 设置窗口    第一排放3个基本窗口+峰图   第二排放k个调补偿窗口
    注意点： 每支流式管上机前，先用400目滤膜过滤

2. blank管调增益

    2.1 运行，调节增益，使FSC-SSC图中细胞位于合适位置
    2.2 记录，圈门，gate活细胞、单细胞，将第二排的窗口gate到其父门上

3. 单标管调补偿

    3.1 下一个试管，重命名
    3.2 修改第二排窗口的纵坐标为所测单标管荧光
        横坐标为所测单标的窗口，纵坐标仍保持SSC
    3.3 运行，记录，调补偿
        补偿矩阵：纵坐标为所测单标荧光，横坐标为被补偿通道
        增大“单标-被补偿通道”值，使右偏的阳性群恢复竖直

4. 样品管分析

    4.1 下一个试管，重命名，运行，记录
    注意点： 每支流式管上机前染DAPI 0.3~0.5ul (溶液体积的1/1000）
    4.2 新建DAPI-SSC图，gate阴性群，标为alive cells,将后面各图的父群修改为alive cells。
    4.2 修改第二排第一张图坐标为CD3--B220，分别gate单阳性群B cells和T cells
    4.3 修改第二排第二张图坐标为Gr1--CD11b，gate双阳性群Neu
    技巧：当表达量难以直接分群时，可以将峰图的横坐标改为对应的荧光，图形最低处即分界线
    4.4 在空白处右键，点击统计设置，显示每个gate中的细胞数、比例和荧光的中位数

5. 下机

    5.1 清洗，follow软件指示（一般为清洗液2min，水4min）
    5.2 关闭仪器和电脑，登记
    5.3 收拾材料，将枪、枪头、滤膜、流式管架、孵育盒放回，弃离心管及细胞废液。