免疫组织化学流程

免疫组织化学Protocol

一、灌注取脑

小鼠经左心室灌注（剪切右心耳）37摄氏度40-50ml生理盐水冲洗，4%的多聚甲醛40ml灌注（灌注过程先快，后慢）；

2. 取脑置于4%多聚甲醛溶液中，后固定24小时； 

3. 后固定后经15%蔗糖溶液脱水24小时，再经30%蔗糖溶液脱水48小时脱水；

4. 脱水完成后，将组织放于小盒内，再将其放入液氮的小杯10~20s（组织不接触液氮），取出组织置于-80摄氏度冰箱存储备用，或置于比冰冻切片机中备用。

免疫组织化学流程

二、切片

1. 组织从-80°冰箱取出后包埋，置于-20°冰冻切片机里复温；

2. 切取脑片，厚度为10-20μm（切片后不立即染色，必须烘干；可储存于4°冰箱低温冰箱保存）。

三、抗原抗体反应及染色

1. 脑片用PBS漂洗3次*5min（洗去包埋剂）；

2. 用5%H2O2（现配现用）常温避光孵育脑片15 min，PBS再次漂洗3*5min；

3. 封闭：5%血清（或用BSA）室温孵育30 min（血清选择与二抗来源一致），甩去多余液体，不洗；

4. 滴加一抗，置于湿盒中，4℃孵育过夜（或按照说明推荐浓度和孵育条件）；

9. 第二天取出后室温孵育2 h，PBS漂洗3*5min；

9. 滴加二抗，室温孵育2 h（或按照说明推荐浓度和孵育条件），PBS漂洗3*5min；

10. 滴加ABC复合物（4℃ 现配现用）室温孵育2 h，PBS漂洗3*5min；

11. 滴加DAB显色剂（-20°冰箱中提前取出复温）避光反应30 min，PBS漂洗3*5min；

12. 苏木素（可以回收）复染3S后，用自来水漂洗直到干净（至少＞3次）

13. 乙醇梯度脱水 75%（1min）→ 95%（1min）→ 100%（1min）

14. 二甲苯透明（2min）

15. 放在滤纸上，于中心滴上少量中性树脂封片，盖上盖玻片（赶出气泡）（保持水平），置于阴凉通风处保存。（如有多余树脂，可用棉签蘸取二甲苯进行擦洗）

四、图像处理

1.显微镜观察

2.免疫组化图片采用Image-Pro-Plus软件处理，对小鼠海马区域Aβ斑块以及星形胶质细胞进行计数。