「三代组装」使用Pilon对基因组进行polish

软件安装

官方提供了编译好的jar包，方便使用

wget https://github.com/broadinstitute/pilon/releases/download/v1.23/pilon-1.23.jar
java -Xmx16G -jar pilon-1.23.jar

如果要顺利运行程序，要求JAVA > 1.7, 以及根据基因组大小而定的内存，一般而言是1M大小的基因对应1GB的内存。

总览

Pilon有如下作用

1. 对初步组装进行polish
2. 寻找同一物种不同株系间的变异，包括结构变异检测

他以FASTA和BAM文件作为输入，根据比对结果对输入的参考基因组进行提高，包括

• 单碱基差异
• 小的插入缺失(indels)
• 较大的插入缺失或者block替换时间
• 填充参考序列中的N
• 找到局部的错误组装

最后它输出polish后的FASTA文件, 以及包含变异信息的VCF文件(可选)

分析流程

推荐使用PCR-free建库测序得到的Illumina paired-end数据，这样子避免了PCR-duplication,有效数据更多，也不需要在分析过程中标记重复。

下面步骤，假设你的组装文件为draft.fa, 质量控制后的illumina双端测序数据分别为read_1.fq.gz和read_2.fq.gz

第一步：比对

bwa index -p index/draft draft.fa
bwa mem -t 20 index/draft read_1.fq.gz read_2.fq.gz | samtools sort -@ 10 -O bam -o align.bam
samtools index -@ 10 align.bam

第二步：标记重复（非PCR-free建库)

sambamba markdup -t 10 align.bam align_markdup.bam

第三步：过滤高质量比对的read

samtools view -@ 10 -q 30 align_markdup.bam > align_filter.bam
samtools index -@ 10 align_filter.bam

第三步：使用Pilon进行polish

MEMORY= #根据基因组大小而定
java -Xmx${MEMORY}G -jar pilon-1.23.jar --genome draft.fa --frags align_filer.bam \
    --fix snps,indels \
    --output pilon_polished --vcf &> pilon.log

一般Pilon迭代个2到3次就够了，所谓事不过三，过犹不及。

关于Pilon的一些参数说明：

• --frags表示输入的是1kb以内的paired-end文库，--jumps表示 大于1k以上的mate pair文库, --bam则是让软件自己猜测
• -vcf: 输出一个vcf文件，包含每个碱基的信息
• --fix: Pilon将会处理的内容，基本上选snps和indels就够了
• --variant: 启发式的变异检测，等价于--vcf --fix all,breaks, 如果是polish不要使用该选项
• minmq: 用于Pilon堆叠的read最低比对质量，默认是0。

阅读日志输出

这个日志文件是标准输出而不是标准错误输出，不过保险起见用&>

最开始，Pilon会输出他的版本信息（如下示例），以及将会对基因组做的调整,

Pilon version 1.14 Sat Oct 31 14:30:00 2015 -0400
Genome: genome.fasta
Fixing snps, indels

其中Fixing后面的含义为：

• "snps": 单碱基差异
• "indels":小的indel的差异
• "amb": 替换原有的N
• "gaps": 填充基因组的gap
• "local"： 检测和修改错误组装
• "all": 上述所有
• "none": 不是上述的任何一种

接着Pilon会分染色体对BAM文件进行处理，根据BAM文件进行堆叠(pileup), 这个时候它会输出有效reads的深度，这里的有效reads包括未成对的read和正确成对的read。

Processing ctg1:1-5414473
frags align_mkdup.bam: coverage 19
Total Reads: 808985, Coverage: 19, minDepth: 5

从Pilon v1.14开始，Pilon还会输出基因组得到确认的碱基比例。

Confirmed 5403864 of 5414473 bases (99.80%)

后续是Pilon将会对原参考基因组做的一些调整的总体情况，如下表示纠正2个snp, 2个小的插入，4个缺失。

Corrected 2 snps; 0 ambiguous bases; corrected 2 small insertions totaling 12 bases, 4 small deletions totaling 6 bases

最后声明当前部分处理结束

Finished processing ctg1:1-5414473

如果，在--fix中选了gaps, 那么输出的内容还有如下内容。其中82048 -0 +276解释为在坐标82428处移除0个碱基，插入276个碱基。

# Attempting to fill gaps
fix gap: scaffold00001:82428-93547 82428 -0 +276 ClosedGap

参考资料

• https://github.com/broadinstitute/pilon/wiki/Standard-Output
• https://github.com/broadinstitute/pilon/wiki/Methods-of-Operation