转录组样本间表达标准化

刘小泽写于19.2.13

做无参真的需要比有参更多的耐心啊

假设现在对两组样本进行转录组测序，得到5个基因（每条基因长度是1kb）的reads count数如下表，其中对照组总共10Mreads，处理组总共50Mreads

基因（都是1kb）	对照组	处理组
a1	2	3
a2	2	3
a3	2	3
a4	2	3
a5	2	38
Totalreads（M）	10	50

目的：想比较某个基因在两个样本中的表达是否差异显著

常用方法是TPM转换，用（每个基因count/基因长度）/ count总数

也就是得到了这个表格

基因（都是1kb）	对照组	处理组	TPM-对照	TPM-处理
a1	2	3	0.2	0.06
a2	2	3	0.2	0.06
a3	2	3	0.2	0.06
a4	2	3	0.2	0.06
a5	2	38	0.2	0.76

意外的是，所有的5条基因都有差异（0.2 <=> 0.06）

按说差异基因只是少数，既然得到的结果都是差异的，那就应该考虑有极值影响，也即是这里的a5基因在处理组中表达量很高，导致其余基因的表达量降低

原因就是：使用TPM得到的结果，其实是每个组内各个基因中的相对表达量。但其实做差异分析时，我们想找到绝对表达量的差别，因此需要对组间的表达量进行标准化

标准化方法一：内参

使用内参基因（看家基因）在不同组织、不同条件下表达恒定，负责生命活动的基本运行，如beta-actin

设置内参基因（假设a1基因是内参），可以给两个样本乘以不同的系数，来让内参基因的表达量达到一致。这里将对照组的a1基因乘以0.3，将处理组的a1乘以0.2，就得到了组间标准化的数据

基因（都是1kb）	对照组	处理组	标准化-对照	标准化-处理
a1	2	3	0.6	0.6
a2	2	3	0.6	0.6
a3	2	3	0.6	0.6
a4	2	3	0.6	0.6
a5	2	38	0.6	7.6

这样看来，只有a5一条基因满足差异要求

但是内参的方法首先需要注释，另外可以当成内参的基因比较少，可能数据中找不到这样的结果

标准化方法二：假设检验

先假设大多数基因不是差异表达的，然后利用统计学方法找到标准化因子

一般使用的差异分析软件中内置了组间标准化的方法：

DESeq2：sizeFactors()，edgeR（TMM方法）：calcNormFctors()

进行差异分析时，输入文件为reads count，然后差异分析软件进行标准化，如果进行Trinity无参分析，可以使用run_DE_analysis.pl

几种差异比较的方法

• 组内比较：TPM（比较不同基因在同一样本中的表达差异）=》需求比较少
• 组间比较： TMM（比较同一基因在不同样本中的差异）=》最为常用
• 二者结合：如Trinity软件中的TMM-normalized FPKM结果文件，在低表达数据过滤、heatmap绘制等【但还是FPKM竟然不是TPM的结果，可能虽然TPM更准确，但使用最多的还是早期的FPKM】

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