生物科研实战——Western blot

western blot实验操作

western blot原理简介：western blot技术主要是通过电泳技术区分不同的蛋白质组分，并将所分离的蛋白质转移至固体支持体上，通过特异试剂和抗体作为探针，对靶蛋白分子含量进行检测的一种方法。

1.蛋白样品提取：

试剂：RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂

（1）取出含有细胞的6孔板，置于冰上进行操作

（2）吸出培养液，加入1ml预冷的PBS清洗一遍，加入PBS时务必沿着板壁注入，避免触碰到孔板底部导致细胞脱落。

（3）吸出PBS，再次加入1mlPBS清洗

（4）用细胞刮轻柔的刮下细胞，将刮下来的细胞连同PBS一起吸入1.5mlEP管中，（注意吸除干净）

（5）将EP管放入离心机中离心，3000r 1min

（6）吸除上清，务必完全吸除干净

（7）汉恒生物RIPA裂解液的配置：RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂（按照1:100体积比分别吸取2ml RIPA裂解液、 20ul蛋白酶抑制剂（PI）,颠倒混匀。【此过程冰上操作】

（8）加入配置好的100ul汉恒生物RIPA裂解液到去除上清后的离心管中，吹打均匀，置于冰上裂解30min，12000r 4℃ 10min

（9）取出上清，依次移取样本上清至对应的新EP管中

2.蛋白样品定量

试剂：BCA试剂A、BCA试剂B、BCA标准品

蛋白定量工作液配制：将汉恒生物BCA试剂A液与B液按照50:1混合均匀

（1）将10ulBSA标准品以及稀释后的待测蛋白样品加入96孔板，每个样品2个复孔

（2）将配置好的蛋白定量工作液加入96孔板中，每孔200ul

（3）将96孔板放入37℃恒温箱中反应30min

（4）将反应完的蛋白样品置于酶标仪进行蛋白样品浓度测定

（5）根据测定的蛋白浓度用RIPA裂解液将不同样品平衡同一浓度

3.蛋白样品变性处理

试剂：SDS-PAGE蛋白上样缓冲液

（1）将汉恒5X样品缓冲液与蛋白样品4:1混合后涡旋振荡混匀

（2）将蛋白样品置于95℃水浴锅中水浴10min

（3）蛋白样品配置完毕可置于-20℃以下保存备用

4.蛋白PAGE胶的配制

（1）玻璃板装配：将玻璃板擦干净，放入制胶器中夹紧

（2）按照配方配制不同浓度的分离胶（下层胶）

（3）将配置好的分离胶灌入玻璃板夹层，加入异丙醇压平分离胶，待凝固，一段时间后，分离胶与异丙醇出现明显的分界线，提示上层胶完全凝固。

（4）倒出上层异丙醇，用滤纸吸干残余的异丙醇

（5）按照配方配制不同浓度的浓缩胶（上层胶）

（6）加入浓缩胶，插入梳子，待凝固。

5.蛋白凝胶电泳

（1）取出PAGE胶，装入电泳槽，上推胶板以避免漏液，装入垂直槽电泳架，装入电泳槽，加入电泳缓冲液

（2）轻柔缓慢拔出梳子，以免破坏胶孔，将槽内电泳液补满。

（3）按照上样顺序进行点样，样本浓度、体积须保持一致

（4）加入蛋白分子量Marker

（5）在泳道两侧加入10ug保护蛋白（即普通蛋白样本）以防止电泳时出现边缘效应

（6）对应正负极盖上盖子，红对红，黑对黑

（7）将电压调至80V进行电泳，气泡出现指示电泳开始，待蛋白样品电泳至下层分离胶时暂停电泳，将电压调至120V继续电泳

（8）根据Marker指示，待目的蛋白电泳至分离胶三分之二处停止电泳。

6.转膜

（1）将裁减掉右上角的PVDF膜泡入甲醇中待用

（2）倒入预冷的转膜液，将转膜夹和海绵完全浸入缓冲液中，放置滤纸（需完全浸湿），确保滤纸与海绵之间无气泡

（3）将电泳完的凝胶玻璃板取出，按照蛋白Marker 切割目的蛋白所在区域的凝胶

（4）将目的蛋白凝胶置于滤纸上，并用转膜液浸湿，将泡完甲醇的PVDF膜置于凝胶之上膜的右上角对应凝胶的右上角

（5）赶除PVDF膜与凝胶之间的气泡，盖上润湿的滤纸，放置时不要引入气泡，合上转膜夹

（6）将转膜夹对应正负极放入转膜槽，黑对黑，白对红，放入冰盒，灌满转膜液，对应正负极盖上盖子。

（7）将电流调至200mA进行转膜

7.丽春红染色

试剂：丽春红染色液

（1）取出汉恒生物丽春红染液待用

（2）转膜完成后，取出PVDF膜，膜上蛋白Marker清晰，胶上无明显蛋白Marker表明转膜完全，去除无蛋白区域，将膜的右上角以便确认膜的方向

（3）将膜置于TBST中清洗，置于汉恒生物丽春红染液中，置于摇床摇动3—5分钟。

（4）摇动结束后，用蒸馏水重复漂洗2—3次直至出现清晰条带，如条带清晰整齐则表明之前Western Blot 步骤成功

（5）置于TBST中重复清洗2—3次直至染液褪去

8.封闭

（1）将PVDF膜取出放入预先配制好的脱脂牛奶（3%—5%）室温缓慢摇动1个小时

9.抗体孵育

（1）将配置好的一抗倒入抗体孵育盒，将封闭完的PVDF膜用TBST清洗一遍后置于一抗中，置于4℃冰箱或者冷库缓慢摇动过夜

（2）过夜后将孵育了一抗的PVDF膜置于TBST中重复清洗3次，每次10min

（3）将PVDF膜置于二抗中室温缓慢摇动1小时

10.显影

试剂：超敏ECL化学发光试剂盒（A液）、超敏ECL化学发光试剂盒（B液）

（1）将汉恒生物影底物A液和B液1:1混合均匀

（2）将PVDF膜控干后平铺于一次性PE手套上，，将汉恒生物显影液均匀涂在PVDF膜上，避光孵育2min

（3）置于Bio-rad自动显影仪器进行目的蛋白显影

11.去除一抗二抗（strip膜再生）

Western 一抗二抗去除液（stripping buffer）,用于Western中转移了蛋白的膜的重复利用。在Western中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测tubulin、actin等表达量相对稳定的蛋白作为参照，或检测某蛋白的翻译后修饰的表达量（磷酸化等）后进行该蛋白的总蛋白表达量检测进行比较。通过使用一抗二抗去除液，充分去除一抗二抗，可以非常方便地重复利用使用过的膜检测其他蛋白。和重新跑一个SDS-PAGE胶相比，不仅省时省力，而且可以消除重新上样而带来的误差，使可比性更强。

（1）将显影完的PVDF膜置于汉恒生物一抗二抗去除液中漂洗10min，室温摇床

（2）弃除一抗二抗去除液并吸尽残余液体加入TBST漂洗3次，每次5min

（3）Strip完成后可再次进行封闭、一抗二抗孵育等Western Blot操作