肽质量指纹图谱PMF分析方法用于蛋白质谱鉴定

肽质量指纹图谱（Peptide Mass Fingerprinting，PMF）是一种简单的蛋白质谱分析方法。用一种特殊的蛋白酶对蛋白质样品进行处理，使蛋白酶以可预测的方式分解该蛋白质样品。最常用的是胰蛋白酶，当然，我们也可以用其他蛋白酶，甚至化学试剂将蛋白质特异性地切割成肽，关键的是要产生特定的切割位点，因为我们必须将蛋白质序列数据库置于相同的切割位点上，以生成一个与之匹配的肽质量列表。然后用质谱法分析这些肽以测定他们的质量。注意，质谱仪器实际上测量的是m/z值，可以转换成质量值。原则上，任何质谱仪都可以用来测量肽的m/z值，但是，通过肽质量指纹图进行精准可靠的蛋白质谱鉴定需要高度精确的质量测量。为了说明这一点，下面给大家举个实例。

人血红蛋白α链通过胰蛋白酶消化得到14个胰蛋白酶肽，其中序列为VGAHAGEYGAEALER的肽的单一同位素质量为1528.7348Da。因此，该肽的单电荷离子的m/z值为1529.7348。在SWISS-PROT数据库中针对所有小鼠和人类蛋白搜索该肽的结果如表1.所示。

表1.质量精度和质量容差对肽质量指纹图谱检索结果的影响。搜索结果由MS-FIT（http://prospector.ucsf.edu）程序提供。

如果我们只能测量出最接近的m/z值（即测量的m/z值为1529），质量容差为1 Da（即测量的质量允许在实际值的±1 Da范围内），则有478个匹配项。换句话说，来自小鼠和人类蛋白质的478个胰蛋白酶肽在1529的±1Da的范围内。如果能够对肽离子进行更精确的m/z值测量，并使用更严格的质量容差，我们最终可以将匹配范围缩小到两个肽。有意思的是，这些是来自人血红蛋白α链的VGAHAGEYGAEALER序列和来自小鼠血红蛋白α链的IGGHGAEYGAEALER。两者的m/z值均为1529.7348，尽管它们因为有四种氨基酸置换而不同。

更精确的m/z测量能为肽质量指纹图谱提供更有用的数据。为了让这种方法起作用，所使用的质谱仪器必须能够测量出与实际值偏差在0.05da范围内的肽质量。具有延迟提取反射分析器的现代MALDI-TOF能够做到这一点，并在这方面有最广泛的应用。然而，用m/z值为1529.73和质量容差为±0.01 Da为目标去搜索，仍然产生25个匹配项（如表1.）。表2.中列出了其中一些与它们相对应的蛋白质。

表2. m/z值为1529.73的肽质量指纹图谱的蛋白质配对表。

所有匹配均在规定的质量容差0.01Da范围内。按照这个标准，这些匹配中的任何一个都可能是我们的目标蛋白质。那么我们该如何从这些非常相似的匹配中识别出正确的蛋白质呢？

答案是--精确的蛋白质谱鉴定通常需要多个肽配对。在表1.的例子中，即使是最好的质量匹配也无法告诉我们所分析的肽是来自人血红蛋白还是小鼠血红蛋白。然而，所有的胰蛋白酶消化的蛋白质样品都会产生多个肽，并产出多个m/z值让我们对照数据库进行搜索。增加搜索肽的m/z值的数量的好处如表3.所示。使用1~2个来自人血红蛋白α的肽m/z值搜索产出了多次配对，而使用3个肽m/z值搜索，仅查出1次配对，即我们要找的正确的蛋白质。

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