相关性分析发挥极致 - 血清代谢组与肠道宏基因组

肠道菌群，血清/血浆代谢组 貌似几乎可以跟一切疾病一切机体状态进行关联，包括本研究的妊娠期糖尿病。孕期糖尿病显然会更复杂，可能改变正常孕期，影响胎儿。

那么妊娠期糖尿病的生理特征是什么样的，血清/血浆代谢物是什么样的，肠道菌群是什么样的，还有其他是什么样的。是病影响了菌群，还是菌群也可以改善疾病。菌群与代谢物与疾病怎么关联分析？

文献题目：综合宏基因组学和代谢组学分析揭示了肠道微生物群衍生的与人类妊娠期糖尿病发展有关的多重影响

样本类型：

疾病组：50名妊娠期糖尿病女性（GDM组），测临床病理指标，血浆代谢组和肠道微生物组；

对照组：54名健康女性（NGT组），测临床病理指标，血浆代谢组和肠道微生物组。

研究结果

1.研究队列的基本特征

50名患有GDM的女性和54名患有NGT的健康女性，年龄无差异，孕24周BMI没有差异，GDM组，TG,中性粒细胞，显著升高，胰岛素水平，HOMA-IR水平，Hb1Ac水平显著升高，表明病人葡萄糖代谢功能障碍(Fig1a)。（思考：病人临床资料统计分析）

2.GDM患者血浆代谢组和肠道微生物组的变化（组学差异分析）

鉴定了119种注释代谢物(Fig1a)。GDM患者表现出2-羟基丁酸（2-HB）和l-α-氨基丁酸的显著增加，但甲硫氨酸亚砜、尿囊素和多巴胺的显著减少（FDRp<.2，Fig 1b）。通路分析显示括多巴胺能突触、甜菜碱生物合成和异喹啉生物碱生物合成在GDM组中表现出显著较低的PAPi评分（Fig1c-e)。回归分析表明，细金拟杆菌、均匀拟杆菌，与这三种多巴胺相关途径呈负相关(Fig1f)，受损的多巴胺代谢与GDM之间存在密切联系。（思考：代谢物差异分析，并进行通路富集，将微生物与代谢做相关性分析）

说明：这里提到的某个代谢过程/通路的PAPi得分，是通过R包PAPi计算出来。https://rdrr.io/bioc/PAPi/。当某个通路显著的激活时，会用上调的代谢物显著富集到该通路说明，这里给出了每个样本该通路的打分值，这个方法确实很直观，值得研究一下。

GDM组和NGT组的肠道微生物群的β多样性和α多样性相似（ANOSIM测试中p=.068），而GDM患者的丰富性显著降低（p=0.028，Wilcoxon秩和检验，补充图1A-C）。

在GDM组中，Faecalibacterium属、Prevotella属和链球菌属的丰度显著降低，相反，GDM组中巨单胞菌属的丰度显著较高（Fig1g)。在物种水平上拟杆菌、真杆菌的丰度显著降低，同时eggerthii拟杆菌的丰度显著增加(Fig1h)。（思考：对微生物组做差异分析，在门，属，种水平上找到显著差异的分类并绘制热图展示）。

3.GDM中细菌共现网络的不同模式（理清菌群重要菌）

GDM患者和NGT对照组的细菌种类分别进行Spearman相关性分析（前50个最丰富物种的FDR p＜0.05，相关系数＞|0.3|）。我们在GDM中确定了Alistipes shahii和Ruminococcus gnavus，在NGT对照中确定了拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomin）、扁头乳杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）和Ruminoccus gnavus为最高程度的核心物种(Fig2a-b)。为了进一步验证两组之间不同的细菌共生关系，从每组中随机选择30个个体进行网络构建（排列=100次）。与NGT对照组相比，GDM患者表现出更高的全局传递性和特征向量中心性得分(Fig2c-f)。（思考，对50种菌两两相关性分析，找出degree高的，绘制网络图，类似于基因的基因共表达网络分析）

由于信号瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）被确定为GDM和NGT患者共现网络中的核心物种，我们研究了GDM组和NGT组之间信号瘤胃球菌连接的差异(Fig 3a-b)。gnavus瘤胃球菌与GDM网络中的一个未分类的Megamonas物种呈正相关(Fig 3a)，与NGT网络中的粪普雷沃氏菌和粪普雷沃氏菌呈负相关(Fig3b)。（思考，选择核心菌，提取其连接的其他菌单独展示讨论互作关系）。

与GDM组相比，在NGT bootstrap构建的网络中，信号瘤胃球菌显示出显著更高的加权程度和加权接近度（p<.05，Fig3cd)。与瘤胃球菌相关的相关系数分布与产生SCFAs的物种Prevotella共沉淀呈负相关（p<.05，Fig 3e)。

4.肠道微生物特征与妊娠期葡萄糖耐受能力显著相关（讨论微生物与糖相关性）

使用“selbal”软件包，我们旨在确定属的平衡，即与GDM相关的几个分类群的相对丰度的几何平均值。在GDM和NGT组之间的交叉验证平衡中，Faecalibacterium prausnitzii粪杆菌是最常见的物种（超过75%）(Fig 4a)。值得注意的是，GDM样本的平衡得分较低(Fig4b)。此外，天平显示出合适的表观辨别准确度（AUC=0.84 Fig4c)。为了揭示肠道微生物平衡与葡萄糖代谢的临床生化参数的关系，应用selbal算法搜索可以预测葡萄糖不耐受的微生物特征。Alistipes onderdonkii和Bacteroides plebeius是OGTT期间与基础葡萄糖水平相关的顶级物种(Fig4d左）。分析进一步表明，在OGTT期间1小时和2小时的血糖水平平衡中，prausnitzii Faecalibacterium是最常观察到的物种（(Fig4d 中间和右侧面板）。分母中较低丰度的物种（如纤维素拟杆菌）与分子中较高丰度的物种如泽泻的比率与空腹血糖水平有关（R2=0.285，左 Fig 4e)。

selbal是一个寻找高度相关变量因素的包，对每个微生物变化进行打分，找出微生物与血糖高相关的关系https://rdrr.io/github/malucalle/selbal/man/selbal.html

5.肠道微生物种类与宿主循环代谢产物及临床特征的关系（讨论微生物与其他临床特征关系）

使用SPLS回归模型来分析，粪杆菌的丰度与一组临床参数呈显著负相关，包括OGTT中1小时的葡萄糖水平（相关系数−0.39）和Hb1Ac（相关系数−0.2 Fig 5a)。甲硫氨酸亚砜水平与孕前BMI、血液中性粒细胞计数和中性粒细胞百分比呈负相关(Fig 5b)。

（思考：讨论临床重要特征跟重要的菌的关系）

5.GDM相关肠道微生物改变与多巴胺代谢紊乱有关（讨论微生物与多巴胺）

SPLS分析显示，血液多巴胺与细金拟杆菌、均匀拟杆菌的丰度呈正相关，但与腐败阿利斯蒂普斯的丰度呈负相关(Fig 6a)。我们在随机森林（RF）回归模型中计算了物种Shapley值。有趣的是，GDM组中Alistipes onderdonkii、拟粪杆菌和Prevotella stercorea的丰度显著较低，对多巴胺能突触(Fig 6b)、甜菜碱生物合成(Fig 6c)和异喹啉生物碱生物合成(Fig 6d)的代谢途径有负面影响（FDR p＜.05）。

思考：本文收集一批糖尿病孕妇的血液，肠道菌群，产生血浆临床指标，血浆代谢组数据，肠道微生物数据，然后详细讨论了三者的关系。找出与重要的代谢物，重要的菌，糖相关的菌，与临床特征相关的菌，多巴胺相关菌。

  本文使用一些比较新的方法，比如代谢通路PAPi评分，微生物菌群共表达网络找hub菌，selbal找高关联度的菌，SPLS分析找高相关度的菌。这些方法或许在其他文献不常见，但我们分析的数据的时候是可以用的。

文献原文：

Trishla Sinha, Siobhan Brushett. (2023) The maternal gut microbiome during pregnancy and its role in maternal and infant health. Current Opinion in Microbiology 74, pages 102309.

原文PDF及译文以及本文分析使用的代码（绘图给出了代码可以仿）如下链接：

https://lifegenes2.oss-cn-shanghai.aliyuncs.com/%E5%85%AC%E4%BC%97%E5%8F%B7%E8%B5%84%E6%96%99/202310/7-Integrative%20metagenomic%20and%20metabolomic%20analyses%20reveal.zip