Sci Adv | 袁健组发现DNA损伤激活自噬新机制

Sci Adv | 袁健组发现DNA损伤激活自噬新机制

原创 BioArt

自噬是一种进化高度保守的生理过程，在清理错误折叠、过量累积的蛋白以及破损的细胞器、维持内环境的稳定等过程具有重要的作用。在多种细胞胁迫的条件下（例如，饥饿、低氧、病原微生物的入侵、活性氧等）能够激活自噬；随着研究的进展，人们发现DNA损伤是激活自噬的一大主要因素之一。DNA损伤激活的自噬参与了DNA损伤修复、细胞程序性死亡、细胞衰老以及细胞因子的分泌等过程的调控，其对维持基因组的稳定性发挥着重要的作用。此外，大量研究表明化疗过程中激活高活性的自噬通常会导致化疗耐受，联合自噬抑制剂和化疗药物已成为一种很有希望克服化疗耐受的治疗方法。
关键自噬相关蛋白（ATGs）的翻译后修饰（例如，磷酸化、乙酰化、泛素化等）在DNA损伤激活的自噬的调控作用已经得到了很好的证实和研究。然而，是否在转录水平上也参与了DNA损伤激活的自噬的调控，目前还不是很清楚。
2020年1月1日，同济大学附属东方医院袁健课题组在**Science Advances 发表题为 “The CHK2—FOXK axispromotes transcriptional control of autophagy” 的论文，阐明了DNA损伤转录激活调控自噬的新机制，此外，也为联合化疗药物和自噬抑制克服化疗耐受提供新的证据和潜在生物标志物。

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CHK2 是一种关键的DNA损伤应答蛋白（DDR），具有丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶活性，其通过磷酸化多个下游底物例如p53、BRCA1、PML等参与细胞周期，凋亡、DNA损伤等生理过程的调控。多个DDR蛋白（例如ATR、ATM、CHK2等）已被证实能够参与DNA损伤激活自噬的调控，但关于CHK2能否调控自噬，目前还不清楚。

在该研究中，作者们首先使用Cisplatin等化疗药物处理A549或者HEPG2细胞，发现随着药物浓度的增加细胞自噬水平逐渐增强。此外，关键自噬相关蛋白的表达（MapLC3B、p62、ATG5、ATG7、ULK1、Beclin1等）也随着处理药物浓度的增加表达渐增多。进一步地，通过qPCR分析，发现关键自噬相关基因的的转录水平也随着处理药物浓度的增加也进一步增强，这表明，在转录水平上参与了Cisplatin、Etoposide诱导的自噬激活。为了进一步阐明这个过程的发生机制，作者们通过联合化疗药物和关键DDR蛋白的抑制剂（ATMi、ATRi、CHK2i、CHK1i）处理细胞，然后检测自噬的自噬水平和关键自噬相关基因的转录水平。发现，ATM或者CHK2抑制剂能够显著抑制Cisplatin诱导的自噬激活以及键自噬相关基因的转录。此外，通过shRNA介导稳定敲低CHK2的表达也显著的抑制Cisplatin激活的自噬，这表明CHK2在DNA损伤激活的自噬中具有重要的调控作用。

为了阐明CHK2调控自噬的分子机制，通过质谱分析，作者们发现FOXK2蛋白是一个新的潜在CHK2结合蛋白。FOXK（FOXK1和FOXK2蛋白的合称）蛋白是FOX转录因子家族蛋白，其可作为一种转录抑制因子通过结合到大量关键自噬基因（MapLC3B、p62、ATG5、ATG7、ULK1、Beclin1等）的启动子上并抑制这些基因的表达，从而抑制自噬的发生。进一步的通过Co-IP实验，作者们发现在由化疗药物Cisplatin等诱导DNA损伤的条件下，激活ATM-CHK2信号通路，进而促进CHK2与FOXK蛋白发生相互作用。CHK2与FOXK蛋白的相互作用是CHK2 T68的磷酸化依赖性的，此外FOXK蛋白的FHA结构域负责与CHK2发生相互作用。

CHK2是一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，其倾向于磷酸化具有RXXS/T保守序列的底物。通过对比分析FOXK1以及FOXK2在不同物种间的氨基酸序列，发现FOXK1的第130位丝氨酸以及FOXK2的第61位丝氨酸是潜在的CHK2磷酸化位点。接着，通过一系列的体内、外磷酸化实验以及订制特性同时能够识别FOXK1的第130位丝氨酸以及FOXK2第61位丝氨酸的磷酸化位点的抗体，发现在DNA损伤的条件下，CHK2被激活进而磷酸化FOXK蛋白（FOXK1在第130位丝氨酸和FOXK2在第61位丝氨酸）。此外，在Cisplatin处理的条件下FOXK蛋白能够发生从细胞核到细胞质的转移。进一步地通过敲低CHK2或者突变CHK2介导FOXK蛋白磷酸化的位点，发现FOXK蛋白从细胞核到细胞质的转移显著受到了抑制。这表明DNA损伤诱导FOXK蛋白从细胞核转移到细胞质是由CHK2介导的。那在DNA损伤的条件下，CHK2介导FOXK的磷酸化从而诱导FOXK从细胞核转移到细胞质具有什么功能呢？在联合敲低FOXK1和FOXK2的细胞中分别回补野生型的FOXK（FOXK WT）以及模拟FOXK去磷酸化的突变FOXK SA（FOXK1 1S130A 和FOXK2 S61A），通过Western Blot，IF以及qPCR等实验检测细胞的自噬水平，发现在DNA损伤的条件下, 与携带FOXK SA突变型的细胞相比携带FOXK WT的细胞激活了关键自噬相关基因的转录进而激活自噬。进一步的通过克隆形成实验，检测了携带FOXK 野生型以及FOXK SA突变型的细胞对化疗药物的敏感性，发现与携带FOXK 野生型的细胞相比携带FOXK SA突变型的细胞对Cisplatin更加敏感，当联合使用自噬抑制剂（CQ，chloroquine）以及Cisplatin处理细胞时可显著提高Cisplatin对细胞的杀伤作用，此外还可以消除携带FOXK 野生型的细胞以及携带FOXK SA细胞对Cisplatin敏感性之间的差异。这表明化疗药物诱导高活性的自噬会导致化疗耐受。

进一步的通过分析TGCA数据库，发现在毗邻CHK2介导FOXK蛋白磷酸化位点附近存在一些突变（FOXK1 I125M、FOXK1 N28K以及FOXK2 I56F、FOXK2 N59K），通过构建相关位点突变的质粒，然后检测这些突变对CHK2介导FOXK磷酸化、FOXK蛋白的定位、DNA损伤激活的自噬以及化疗药物敏感性的的影响，发现与野生型的细胞相比，在DNA损伤的条件下，FOXK1 N128K的突变以及FOXK2 N59K的突变诱导CHK2介导FOXK蛋白的高磷酸化，进一步促进FOXK蛋白的细胞质定位以及细胞自噬。通过体外克隆形成实验以及体内的裸鼠形成实验，发现与野生的细胞相比携带FOXK NK（FOXK1 N128K和FOXK2N59K）突变的细胞对cisplatin更为耐受，当使用自噬抑制剂和化疗药物联合使用时可以消除FOXK NK突变导致的耐受。这表明FOXK NK突变通过诱导高活性的自噬进而导致化疗耐受。

综上所述，该研究阐明了通过CHK2-FOXK信号轴调控DNA损伤诱导自噬的分子机制；鉴定出FOXK蛋白是新的CHK2的底物并找出FOXK1的130位丝氨酸（FOXK1 S130）、FOXK2的第61位丝氨酸（FOXK2 S61）是CHK2在DNA损伤条件下介导的FOXK磷酸化位点，进一步的通过体内外细胞实验证实了CHK2通过FOXK蛋白转录调控DNA损伤诱导的自噬并进一步验证了化疗药物诱导高活性的自噬会导致化疗耐受，联合自噬抑制剂可以显著提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果。此外，本研究发现邻近CHK2介导FOXK磷酸化位点的突变（FOXK1N128K、FOXK2 N59K）会诱导高活性的自噬，进而导致化疗耐受，但在联用自噬抑制剂和化疗药物可以消除这个突变导致的化疗耐受。这些结果表明，CHK2介导的FOXK蛋白的磷酸化水平是潜在联合化疗药物和自噬抑使用克服化疗耐受的生物标志物。

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袁健教授课题组的博士研究生陈玉平以及硕士研究生锦欢是本文的第一作者，袁健教授为本文的唯一通信作者。原文链接：https://advances.sciencemag.org/content/6/1/eaax5819