单细胞分析---拟南芥例子初体验

因为我是主要做植物的，所以先找了个拟南芥的例子（A single-cell RNA sequencing profiles the developmental landscape of Arabidopsis root）。

首先下载数据：

从文章给出的下载链接下载：

https://bigd.big.ac.cn/gsa/browse/CRA001559/CRR054647

下载完数据，我们可以发现2个文件：

CRR054647_f1.tar.gz

CRR054647_r2.fastq.gz

解压之后为：CRR054647_r2.fastq.gz Root_I1.fastq.gz Root_R1.fastq.gz

为了准备cellranger的input，修改文件名为：

Root_S1_L001_I1_001.fastq.gz  

Root_S1_L001_R1_001.fastq.gz 

Root_S1_L001_R2_001.fastq.gz

与普通fastq文件相比，单细胞RNASeq fastq文件包含条形码和唯一分子标识符（UMI）的额外信息。从文件大小也能看出来，只有read2是转录本序列。

======================================QC============================

Root_S1_L001_I1_001.fastq.gz    Root_S1_L001_R1_001.fastq.gz  Root_S1_L001_R2_001.fastq.gz

整体测序质量还是可以的。下面进行cell的鉴定。我先试了2种不同的工具。

=====================cellranger===================================

cellranger count --id run_count_1kpbmcs --fastqs root/ --sample Root_S1 --transcriptome refdata/

barcode rank plot estimated number of cells reads的比对情况

可以看出，cellranger给出的cell预估数目是14539，Median Genes per Cell是1036，Median UMI Counts per Cell是1972，总共检测到的基因数目是24060。

===========================利用umi_tools进行鉴定========================

umi_tools whitelist -I ../root/Root_S1_L001_R1_001.fastq.gz -p CCCCCCCCCCCCCCCCNNNNNNNNNN --plot-prefix=QC --log2stderr > whitelist.txt

cell barcode counts

与cellranger相比，曲线是基本一致的，但是cutoff的点相差真的很大，所以我现在比较迷惑到底什么是true cell的筛选标准。这2中方法的cutoff的阈值到底哪个更合理。