互作研究：RNA m6A修饰促进玉米籽粒发育过程中的DNA甲基化

mRNA中的N6-甲基腺苷（m6A）和DNA中的5-甲基胞嘧啶（5mC）对于调控基因表达和调节植物生长发育具有关键功能。然而，m6A和5mC之间的互作是一个难以捉摸的领域，在植物中的机制尚不清楚。

2023年11月23日，中国农业大学贺岩教授课题组以“RNA m6A modification facilitates DNA methylation during maize kernel development“为题在《Plant Physiol》杂志发表研究论文，研究揭示了玉米（Zea mays）籽粒发育过程中m6A和5mC之间的密切关系，至少部分归因于ZmMTA（Zea mays MTA，m6A关键参与因子）和ZmDDM1（5mC关键参与分子）之间的相互作用，且RNA修饰和DNA甲基化之间的互作可能在植物中保守。

标题：RNA m6A modification facilitates DNA methylation during maize kernel development（RNA m6A修饰促进玉米籽粒发育过程中的DNA甲基化）

时间：2023-11-28

期刊：Plant Physiology

影响因子：IF7.4/1区

技术平台：MeRIP-seq（m6A-seq）、BS-seq、RNA-seq等

研究摘要：

本研究通过m6A-seq和BS-seq等分析揭示了玉米（Zea mays）中m6A和5mC之间通过mRNA腺苷甲基化酶（ZmMTA）（m6A甲基转移酶复合体的关键因子）与DNA甲基化1（ZmDDM1）（调控DNA甲基化的关键染色质重塑因子）减少之间的相互作用而发生串扰。与无m6A修饰的基因相比，带有m6A修饰的基因具有更高水平的DNA甲基化。ZmMTA功能丧失导致玉米胚胎发生和胚乳发育过程中严重停滞，导致m6A修饰基因5'区CHH甲基化显著降低。而ZmDDM1功能丧失对ZmMTA相关活性没有明显影响。这项研究在玉米籽粒发育过程中建立了m6A和5mC之间的直接联系，并提供了RNA修饰和DNA甲基化之间相互作用的见解。

研究结果

（1）RNA m6A修饰与DNA甲基化之间的相互作用

图1：m6A修饰和DNA甲基化的协作。 A. 在genebody及其±2 kb区域中，比较每个序列背景（CG，CHG和CHH）的所有基因（带有或不带有m6A修饰）的DNA甲基化水平。m6A修饰基因是指具有m6A peaks的基因，m6A沉默基因是指没有m6A peaks的基因。总基因n=20316，带有m6A修饰基因n=7472，不带有m6A修饰基因n=12844。使用双侧Wilcoxon符号秩检验进行统计分析：*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。 B. 不同m6A强度的基因的DNA甲基化谱。所有m6A修饰基因根据m6A强度从高到低分为3组，分别用红色、蓝色和黑色表示。将具有高水平和中等水平m6A修饰基因分别与具有中等水平和低水平m6A修饰的基因进行比较。每组基因n=2490。统计学分析采用双侧Wilcoxon符号秩检验：*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。

（2）ZmMTA在玉米胚乳发生和胚乳发育中的作用

图2：ZmMTA功能丧失严重阻碍了玉米的胚胎发生和胚乳发育。 A. ZmMTA基因结构图和EMS突变位点。黑色框和白色框分别表示外显子和UTR。红色框表示MT-A70域的编码区。EMS突变位点用三角形标记。 B. zmmta-1/+在14 DAP（左）和成熟期（右）的自交穗。代表性的突变核用红色箭头表示。对图像进行数字提取以进行比较。Bar=1 cm。 C. 4~14 DAP野生型和zmmta-1突变体核的石蜡切片。这些切片用碱性品红染色。Bars=1 mm。 D. 突变位点的野生型和zmmta-1突变体进行Sanger测序。 E. Western blot检测野生型和ZmMTA-1突变体核中ZmMTA蛋白的表达。 F. 野生型和zmmta-1突变体在14 DAP时的流式细胞术图谱。C值显示在每个peak顶部。 G. LC-MS/MS分析显示野生型和zmmta-1突变体的总mRNA m6A丰度。数据代表3个生物学重复的平均值±SD。统计分析采用t检验。 

（3）zmmta功能丧失影响大量基因的表达和胚胎发育

图3：野生型和zmmta-1突变体中转录组比较分析。 A~B.  相对于野生型，zmmta-1突变体中的DEGs（A）或TEs（B）。DEGs（或TEs）（倍数变化≥2，FDR<0.01）用红色或蓝色表示，而未变化的基因（或TEs）用灰色表示。 C.   zmmta-1胚胎中下调（上）或上调（下）DEG的GO富集分析。圆圈的大小表示DEG的数量。颜色表示每个GO项的-log 10（P值）。

（4）ZmMTA对于m6A修饰基因的5'区域的mCHH是必需的

图4：ZmMTA促进m6A修饰基因5'区的mCHH。 A） 野生型和zmmta-1突变体中的整体DNA甲基化水平。使用Fisher精确检验对野生型和zmmta-1突变体进行统计分析，共有3个生物学重复：*P<0.05和**P<0.01。 B） 野生型和zmmta-1突变体中带有或不带有m6A修饰的基因中DNA甲基化（CG，CHG和CHH）的宏基因谱。野生型和zmmta-1突变体中m6A+的n=7472，m6A-的n=12844。使用野生型和zmmta-1突变体之间的双侧Wilcoxon符号秩和检验进行统计分析：*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001。

（5）ZmMTA与ZmDDM1的相互作用

图5：ZmMTA与ZmDDM1相互作用。 A） ZmMTA和ZmDDM1的Co-IP（共免疫沉淀）实验。野生型ZmDDM1 的IP产物中检测到ZmMTA，但未从ZmDDM1突变体中检测到。同样，在野生型的ZmMTA-IP产物中检测到ZmDDM1，但未从ZmMTA-1突变体中检测到。 B） Y2H（酵母双杂交）实验显示ZmMTA与ZmDDM1A或ZmDDM1 B的相互作用。AD表示GAL4激活域；BD表示GAL4 DNA结合结构域。使用空的pGADT7和pGBKT7载体之间的相互作用作为阴性对照。 C） LCI（荧光共振能量转移）实验显示N.benthamiana叶片中ZmMTA与ZmDDM1A或ZmDDM1B的相互作用。左上部分显示互作信号；其他3个部分显示阴性对照信号。每个部分旁边的标签表示特定的组合。荧光信号强度表示相互作用活性。

（6）RNA m6A修饰促进ZmDDM1靶向TSS

图6：m6A促进ZmDDM1与TSS（转录起始位点）的结合。 A. 饼图描绘了ZmDDM1A和ZmDDM1 B在带有或不带有m6A修饰基因的5个片段的peaks分布。ZmDDM1-occupied基因是指具有ZmDDM1 peaks基因，而ZmDDM1-unoccupied基因指没有ZmDDM2 peaks的基因。 B. 野生型ZmDDM1占比Metaplots图。基于m6A修饰和ZmDDM1A（左）和ZmDDM1B（右）占比情况将所有表达的基因分为4类。在有或没有ZmDDM1A基因之间进行比较。使用双侧Wilcoxon符号秩检验进行统计分析：*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。 C. 野生型基因mCHH的Metagene图谱。所有表达基因根据m6A修饰和ZmDDM1A（左）和ZmDDM1B（右）被分为4类。在有或没有ZmDDM1B基因之间进行比较。使用双侧Wilcoxon符号秩检验进行统计分析：*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

（7）ZmDDM1变化对ZmMTA相关活性没有影响

图7：ZmDDM1对ZmMTA相关活性没有影响。 A. 野生型和zmddm1突变体中ZmMTA转录本丰度的RT-qPCR分析。数据代表3个生物学重复的平均值±SD。使用Student t检验进行统计分析。 B. 野生型和zmddm1突变体中ZmMTA蛋白丰度的Western blot分析。 C. 野生型和zmddm1突变体中的ZmMTA蛋白免疫定位分析。Bars=5μm。 D. LC-MS/MS分析显示野生型和zmddm1突变体中的整体mRNA m6A丰度。数据代表三个生物学重复的平均值±SD。使用Student t检验进行统计分析。 E. 野生型和zmddm1突变体中m6A位点沿标准化转录本分布的Metagene图谱。 F. 饼图描绘野生型（左）和zmddm1突变体（右）中非重叠转录本片段中的m6A peaks分布。

研究小结

本研究通过MeRIP-seq和BS-seq的综合分析揭示了m6A和5mC之间的全基因组关联，并表明了RNA m6A甲基转移酶ZmMTA与染色质重塑因子ZmDDM1相互作用，并可能促进其靶向TSS。本研究揭示了m6A和5mC之间的相互作用，并表明RNA修饰信息从RNA直接传递至DNA，以调控复杂的表观基因组。考虑到m6A和5mC在介导基因表达中的广泛作用，这种动态变化可能在许多细胞环境中具有重要的调控功能。

参考文献：LuoJH, Guo T, Wang M, Liu JH, Zheng LM, He Y. RNA m6A modification facilitates DNAmethylation during maize kernel development. Plant Physiol. 2023 Nov 23. pii:7444906. doi: 10.1093/plphys/kiad625. PubMed PMID: 37995374.