单细胞专题（1） | 单细胞转录组研究样本准备指南（下）

       上篇文章我们全面的了解了组织、血液、细胞以及特殊类型等样本做单细胞转录组测序的制备指南，本文我们继续来学习下分选细胞样本制备方法，有需要的老师们一定要收藏哦！

01  流式分选

       流式细胞分选利用荧光素标记不同的分子，通过调节合适的电压、补偿等，将目的细胞与非目的细胞区分开来。在单细胞测序领域，流式分选可以区分特定细胞群体，并能够对单细胞悬液进行质量优化，让研究目的性更强、准确性更高。

实验建议

       1.分选前建议先做预实验，了解目标细胞的含量占比，以此优化流式细胞仪的分选条件；

       2.分选时间：根据所分选细胞的耐受情况而定，保证细胞活率，建议在一小时之内完成；

       3.细胞收集液：1×DPBS (或培养基) + 0.04％BSA / 5%FBS。

       4.对于流式分选的细胞，需遵循非必要不冻存的原则。

优劣势

       1.流式分选时间较长，对细胞刺激大；

       2.流式分选可进行多参数、不同荧光强度的分选，且可进行多路分选，方式灵活，纯度高（>90%）；

       3.流式分选对设备要求较高，需要分选型流式细胞仪。

02  免疫磁珠分选

       免疫磁珠细胞分选是在磁珠上连接能够与细胞表面抗原结合的特异性抗体，通过外加磁场，抗体与磁珠相连的细胞被吸附从而滞留在磁场中，以达到细胞分离的目的。根据所标记细胞的不同，磁珠分选通常可分为阳性分选和阴性分选两类。

实验建议

       1.对于磁珠分选，阳选、阴选试剂盒的区分和选择尤为重要，需要关注分选试剂的可靠性、分选效率等；

       2.预实验估测目标细胞比例，便于正式样本准备；

       3.稀有细胞分选可选用采用复合分选法，此种方法主要用于细胞亚群的分选或高纯度细胞分离；

       4.分选后的细胞容易结团，避免高速离心富集。

优劣势

       1.磁珠分选速度快、刺激小，获得的细胞活率高；

       2.磁珠分选的分选精度有限，少量非目标细胞可以在数据分析阶段进行剔除；

       3.磁珠分选对设备要求较低，需要磁珠分离装置。

03  注意事项

       1.裂红处理：原样品中若有肉眼可见红色沉淀，应先裂解红细胞，但需注意裂解时间，避免对其它细胞造成损伤；

       2.计数矫正：流式分选的细胞计数值可能会比真实细胞总量偏高（20-80%），需要计数仪或镜检进行计数矫正；

       3.收集细胞：建议离心机转速在500g以内，超过500g容易导致细胞重悬不开或结块；如果担心收集不到细胞，可增加离心时间。

收集不到细胞原因可能有：

       1.离心机故障或陈旧，离心力低于设置值。

       2.细胞重悬液体积过大，或血清含量过高。

       3.存在细胞直径过小的细胞类型。

       4.最终的单细胞悬液需符合上机要求：

       •镜检背景干净，无明显细胞碎片、杂质，团块

       •细胞活率：＞80%

       •细胞结团率：＜10%

       •细胞总数＞1×10^6，细胞浓度在700-1500个/μl之间