NGS015 单细胞测序（上）
1 背景介绍
1.1 发展历程
全球单细胞测序技术研发从 2009 年开始起步，里程碑事件是汤富酬教授发表了世界第一篇单细胞mRNA 测序的文章。
国内单细胞测序技术的应用从 2014年开始起步，大部分在科研阶段，部分临床应用在初步探索阶段，包括胚胎植入前遗传学检测（PGS/PGD）、外周循环肿瘤细胞检测（CTC）等。
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1.2 市场情况
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单细胞测序是 NGS精细和深度测序的应用场景之一，也是多技术和多学科的交叉应用。产业链上游为仪器和试剂提供方，包括单细胞/单细胞核制备、分选、建库和测序。国外的解决方案提供商，如 BD、10x Genomics 和 Illumina 等占据着主要的市场份额。国内企业进场较晚，华大智造在 2019年刚刚推出便携式单细胞系统整套装置，新格元在2020年 6月刚推出单细胞测序文库构建系统，尚未形成影响力。
产业链中游的单细胞测序服务提供方则更为分散。一部分为头部基因测序服务企业，他们主要通过购买 BD 和 10x Genomics 等公司的单细胞平台来提供单细胞测序数据生产服务，而另一部分为专注于单细胞实验和分析技术服务及细分领域应用的企业。
产业链下游目前尚未成型，集中在科研机构、临床科研平台及药企研发中心等，大部分以科研合作的方式共同进行科学发现、技术迭代和研发项目等。
2 单细胞技术介绍
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2.1 目前主要有两种策略来实现单细胞测序
2.1.1 将单个细胞分离出来并独立构建测序文库
可通过流式细胞术（含微流体芯片）或者激光捕获显微切割（LCM）实现。
2.1.2 基于标签（Barcode）的单细胞识别
给每个细胞加上独一无二的标签序列，这样在测序的时候，就把携带相同 Barcode 的序列视为来自同一个细胞。这种策略，可以通过一次建库，测得上千个单细胞的信息
2.2 单细胞测序的实验流程主要包括
- 单细胞悬液制备
- 单细胞/单细胞核制备
- 细胞分选和文库制备
- 测序和生信分析等部分
2.3 单细胞悬液制备
单细胞制备是单细胞测序的第一步，必须要制备高质量的单细胞悬液。样本制备的具体方案因组织类型各异，例如血样，可以采用密度梯度离心的方法；对于组织样本，通常采用机械法或酶解法
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在单细胞制备中，富集特定的细胞群，或去除不需要的细胞群（包括死细胞）是一个可选的步骤，通常也是一个关键步骤，尤其是对稀有细胞或珍贵样本
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2.4 单细胞分离方法及平台
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2.5 单细胞制备方法选择
- 从单细胞测序公司官网查询单细胞悬液制备官方protocol
- 利用关键词检索文献，或参考知名protocol分享网站，选择适合自己的protocol
- 选用单细胞悬液制备或细胞分选的商业试剂盒，如10×官方推荐Miltenyi
2.6. 单细胞文库制备
2.6.1 转录组
Hedlund E, Deng Q. Single-cell RNA sequencing: technical advancements and biological applications[J]. Molecular aspects of medicine, 2018, 59: 36-46.
- 对于单细胞转录组测序，基于试剂盒的建库流程以 SMART-Seq 和 SMART-Seq2 最为经典。这两种技术均是在单细胞分选后进行全反转录扩增（WTA）获得单细胞 cDNA文库，再进行 cDNA预扩增（可选）或直接采用常规基因组测序文库的制备等步骤。SMART-Seq 和SMART-Seq2由Illumina 公司、路德维格癌症研究所的理查德桑德伯格实验室和卡罗林斯卡医学院共同开发，目前由TaKaRa子公司Clontech实际经营
- 建库过程中扩增方式的不同，会有不同的影响。PCR 为非线性扩增，效率取决于序列；IVT 为线性扩增，需要对 RNA 多一轮反转录，造成额外的 3′偏差。
- 比如 CEL-seq（包括 CEL-seq2）、Drop-seq、 Microwell-seq、MARS-seq 等方法对 3’端具有偏向性
- Smart-seq（包括 Smart-seq2）、seq-well、 SCRB-seq等则偏向于全长转录组
2.6.2 基因组
Ref:Lei H, Fei M, Chapman A, et al. Single-cell whole-genome amplification and sequencing: methodology and applications[J]. Annual Review of Genomics & Human Genetics, 2015, 16(1).
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DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction)
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技术原理：简并寡核苷酸引物PCR，引物的3‘ 含6bp的随机序列，可以随机的和基因组DNA结合，从而实现对全基因组的扩增。
应用范围：因为PCR的指数扩增特性，放大了基因组上不同序列之间的差异，因而导致扩增出的基因组覆盖度较低。尽管如此，在1M bin size的水平上，DOP-PCR适合对染色体的CNV进行定量。
商品化试剂盒：Sigma-Aldrich, GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit
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MDA (Multiple Displacement Amplification)
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技术原理：2001年由Laskin团队发明，使用随机的6聚体引物和φ29DNA聚合酶进行反应，该聚合酶具有很强的链置换特性，能够在等温的条件下，扩增产生50~100kb的DNA片段。同时由于其3’-5’核酸外切酶活性和校对活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的复制保真性。
应用范围：MDA法比DOP-PCR拥有更高的基因组覆盖度。但是，和DOP-PCR相同，MDA法依然是指数扩增，因此依然存在PCR反应的序列偏好性。
商品化试剂盒：Qiagen, REPLI-g Single Cell Kit
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MALBAC (Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles)
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技术原理：2012年由谢晓亮团队发明，降低了指数扩增的序列偏好性。扩增引物的5’含有27bp通用序列，3’是8bp的随机序列，可以和模板在1520℃的低温下结合，经过812个循环的拟线性扩增后，再对这些环状的扩增子进行指数扩增。
应用范围：MALBAC法的优势序列偏好性在不同的细胞之间是可重复的，另外，由于其扩增的均一性，MALBAC法扩增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱点在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29。
商品化试剂盒：Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit; Rubicon, PicoPLEX WGA Kit。
2.6.3 表观遗传组
Shema E, Bernstein B E, Buenrostro J D. Single-cell and single-molecule epigenomics to uncover genome regulation at unprecedented resolution[J]. Nature genetics, 2019, 51(1): 19-25
表观遗传学是控制基因活动的时间和空间的机制，与DNA序列无关，其在胚胎发生、分化、谱系特征和癌症进化中发挥着至关重要的作用。单细胞表观基因组学技术可与RNA表达和SNP数据相结合，进而确定表观遗传学在基因精确调控中的机制作用。
2.7 单细胞文库质控
2.7.1 单细胞测序数据的产出量和质量的影响因素
- 单细胞分离效果
- 提取的 DNA 或RNA 的质量
- 扩增出的全基因组（转录组）的覆盖度和一致性
- 文库的质量
- 上机前的文库量
2.7.2 文库的大小分布
- 琼脂糖凝胶电泳
- 微流控片段分析仪
- Agilent 2100 Bioanalyzer
- BIOPTIC Qsep
2.7.3 文库浓度
- 实时荧光定量 PCR 仪
- Qubit 荧光定量仪
2.8 测序及数据分析
第二部分见NGS016 单细胞测序（下）
