提问使人快乐！Western Blot 结果条带全面分析

2018-01-31 本文已影响0人东澳生物

"提问使人快乐"

一篇科学网的热门博客这样说：

因提出问题，

即丰收在望！

做了多年Western Blot，

各种奇形怪状的结果条带，

是否已经集齐，

可以召唤出一部3天3夜的故事了？

比如：一个做 western blot 的小女孩、、

小编已集齐14只“神兽”，

成功召唤出“神龙”

对Western Blot 结果条带进行全面分析：

出来吧，比卡丘~

1. 啥也没有

[原因]：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。

[解决办法]：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。

[经验]：上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。

2. 高背景

[原因]：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够

[解决办法]：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。

[经验]：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。其实只要我们注意操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。

3. 非特异性条带

[原因]：一抗非特异性与蛋白结合

[解决办法]：更换一抗

[经验]：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。

4. 条带中出现边缘规则的白圈

[原因]：电转中膜和胶之间存在气泡。

[解决办法]：转膜前去掉膜和胶之间的气泡

[经验]：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧中间，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用U型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。

5. 条带中间出现白色（反白）

[原因]：中心部位高浓度HRP把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了

[解决办法]：降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度。

[经验]：如果你足够迅速，可以在中间部位底物消耗之前就把X光片给定影出来，但是时间很难把握，建议还是从降低蛋白量，降低一抗二抗浓度入手。

6. 出现黑点和黑斑

[原因]：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合

[解决办法]：封闭牛奶一定要纯，封闭结束之后要洗

[经验]：我们常常是等到要封闭的时候发现没有牛奶，然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置，配的匆忙的时候往往不管是否已经完全溶解，如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上，会导致很多不溶性颗粒附着在膜上，这就会导致发光时候膜上的黑点。所以牛奶溶解之后，最好静止一下，然后轻轻地吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束之后一定要洗三遍之后再加一抗。

7. 条带拖尾

[原因]：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长

[解决办法]：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。

[经验]：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议5min*5次，不要但是洗这么多次就把抗体和蛋白洗掉了，你又不是拿刀在上面刮，真正的抗原抗体的结合是通过这种方式洗不掉的。

8. 出现重影