这是一篇发表在4分左右sci的环状RNA文章

摘要

• 摘要背景：环状rna（circRNAs）在人类肿瘤研究中越来越受到重视。然而，仍有大量未知的环状rna需要被研究。本研究旨在探索新的环状rna及其在肝细胞癌（HCC）中的作用机制。
• 方法：采用大数据挖掘、逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和计算生物学相结合的方法，对肝癌相关基因进行研究，探讨其可能的作用机制。采用CMap分析，探讨肝癌的潜在治疗药物。
• 结果：采用RobustRankAggreg方法，从GSE78520、GSE94508和GSE97332三个基因表达全微阵列数据中获得6个不同表达的CircRNA。在RT-qPCR确证后，选择了三种环状rna（hsa-u-circRNA-u102166、hsa-u-circRNA-u100291和hsa-u-circRNA-u104515）进行进一步分析。预测了三种circRNAs的miRNA反应元件。共鉴定出5钟circRNA-miRNA相互作用，包括2种circRNA（hsa-circRNA-u104515和hsa-circRNA-u100291）和5种miRNA（hsa-miR-1303、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-877-5p、hsa-miR-583和hsa-miR-1276）。收集上述5个miRNAs的1424个靶基因和3278个不同表达基因（DEGs）。通过miRNA靶基因与DEGs的交叉，我们获得了172个重叠基因。建立了一个基于172个基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络，其中7个hub基因（JUN、MYCN、AR、ESR1、FOXO1、IGF1和CD34）由该网络确定。富集分析显示，这7个hub基因与一些与癌症相关的生物学功能和途径有关。此外，通过CMap分析，基于7个hubgenes的3种生物活性化学物质（德西他滨、BW-B70C和吉非替尼）被确定为肝癌的治疗选择。
• 结论：本研究从circRNA-miRNA-mRNA网络的角度为肝癌的发病机制和治疗提供了新的思路。

研究背景

1976年首次发现的具有完全闭环结构的RNA。然而，由于传统RNA检测方法的局限性，这些没有poly-A尾巴的转录本长期被忽视。近年来，随着高通量测序技术的发展，在真核转录组中发现了大量的circRNAs。circRNAs具有细胞类型特异性和跨物种高度保守的特点，被认为是在多种疾病中起重要作用的新的星形rna，包括人类癌症。

竞争性内源性rna（ceRNAs）是作为miRNA海绵的转录物，通过与其他miRNA的竞争性结合在转录后水平上相互调节。近年来，由于circRNAs具有丰富的保守miRNA反应元件（MREs），已成为ceRNA家族研究的新热点。越来越多的研究表明，ceRNA机制参与了肿瘤的发生和发展。例如，经典的cirRNA，ciRs7，被认为吸收miR-7并释放miR-7对许多人类癌症靶基因的抑制作用。CircRNAs作为ceRNAs介导的病理过程在HCC中也有报道。

本研究采用基因芯片与计算生物学相结合的策略，探讨肝癌细胞中的新结构及其可能的作用机制。流程图概述了目前的工作，如图1所示：首先，我们从基因表达总集（GEO）收集了提供circRNAs表达谱的微阵列数据集，用RobustRankAggreg法获得不同表达的circRNAs（DECs），并用逆转录定量聚合酶链反应（RT qPCR）证实其表达。为了研究DECs在HCC中是否作为cerna发挥作用，我们收集了它们的海绵miRNA和miRNA靶基因，构建了一个circRNA-miRNA-mRNA网络。随后建立了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并鉴定了hubgenes。然后，通过基因肿瘤学（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和hubgenes的反应性富集分析，阐明HCC的潜在发病机制。此外，我们还进行了连接性图谱（CMap）分析，以获得治疗肝癌的生物活性化合物，这为进一步研究circRNAs在肝癌中的潜在治疗能力提供了新的视角。

研究方法

• 从GEO微阵列数据中筛选肝癌中的DECs
  提供HCC中circRNA的表达谱。所有的原始表达式数据都被规范化，log2被转换。首先，我们使用Limma，一个用于微阵列数据差异分析的生物导体包，以| log2（foldchange）|>1和P值<0.05为标准来确定每个数据集中的DECs。然后，我们用R包RobustRankAggreg对所有DECs进行了整合和排名。

• 使用RT qqPCR方法验证
  对十六对新鲜冷冻的肝癌组织和相应的相邻非肿瘤组织进行验证，样本来自广西医科大学附属第一医院的HCC患者的诊断结果。这些患者术前未接受放疗或化疗。广西医科大学附属第一医院伦理委员会批准了这项研究。按照制造商的说明，使用TRIzol®试剂（美国赛默飞世尔科学生命技术公司）分离总RNA。然后，用Geneseed®II第一链cDNA合成试剂盒（Geneseed，中国广州）将1μg总RNA逆转为20μl互补DNA（cDNA）。RT-qPCR使用Geneseed®qPCR-SYBR®绿色主混合物（Geneseed）在ABI7500系统（美国加利福尼亚州Applied Biosystems）上按照制造商的程序进行。β-肌动蛋白（Geneseed）作为内源参考。本研究中使用的所有引物序列均由Geneseed合成，如表1所示。CircRNA的表达用2-ΔCT法测定。采用SPSS 22.0软件进行配对T检验，分析各组间的显著性。P值<0.05表示有统计学意义。

• MREs的预测
  miRNA结合位点，也被称为MREs，是用两个网络工具CircRNA（CSCD）和circinteractiome预测出来的。我们将两种算法的重叠的miRNAs识别为DECs的潜在靶miRNAs。

• 基于GEO和TCGA微阵列数据集的miRNA表达验证
  提供了肝癌miRNA表达谱，这些数据来自GEO和癌基因组图谱（TCGA）的公共数据库。检索公式： (hepatocellular OR hepatic OR liver OR HCC) and (“cancer” OR “tumor” OR “tumour” OR “carcinoma” OR “neoplasm” OR “malignan*”) and (miRNA OR microRNA OR miR OR “noncoding RNA” OR ncRNA OR “noncoding RNA” OR “non coding RNA”)。我们根据所列的纳入标准筛选了可用的数据集：（1）所有患者都被诊断为肝癌；（2）研究必须包含癌组织和正常肝组织中的circRNA表达数据；（3）肿瘤组和非肿瘤组的样本量至少为3。分别提取了每个收录记录的基本信息：miRNA类型、第一作者和发表年份、地区、数据源、平台、病例数、miRNA表达水平。用STATA 12.0（StataCorp，College Station，TX，USA）计算组合标准差（SMD）和95%可信区间（95%CI）。SMD>0代表肝癌组织中miRNA的高表达。相应的95%可信区间不超过1，P值<0.05表明有统计学意义。

• miRNA靶基因的预测
  miRNA-mRNA的相互作用用miRWalk 2.0进行预测，涉及12种预测算法（Targetscan，rnahybridge，RNA22，PITA，Pictar2，miRWalk，Microt4，miRNAMap，miRDB，mirbridge，miRanda和miRMap）。选择至少8个算法预测的目标基因进行进一步分析。

• 从TCGA数据库搜集差异基因 (DEGs)
  从TCGA下载了374份HCC样本和50份正常对照的TCGA-RNA序列（RNA-seq）不同表达基因（DEGs）数据。用edgeR包测定生物导体中的DEGs，过滤标准为| log2（foldchange）|>1，调整P值<0.05。

• circRNA-miRNA-mRNA网络的构建
  预测的miRNA靶基因与DEGs的重叠基因用于circRNA-miRNA-mRNA网络的构建。使用Cytoscape 3.6.1软件可视化调控网络。

• PPI网络的建立和hub基因的鉴定
  PPI网络是string数据库（v10.5）建立的，然后由Cytoscape 3.6.1软件进行可视化。然后，采用基于节点加权算法的“Molecular Complex Detection”（MCODE）来识别大规模PPI网络中的局部密集连接区域。

• 富集分析
  用超几何分布法对聚类进行了GO注释和Kegg路径分析，并对基因群集的功能分类和富集进行了R包。Reactome路径分析是由Reactome Fi进行的，这是一种用于 network和pathway 分析的插件。

• CMap分析
  Hubgenes包含两个上调和下调列表，上传到CMap网络工具中，与人类细胞系中1309种生物活性化合物治疗后的7000多个基因表达谱匹配。感兴趣的基因和来自CMap的化学品之间的匹配通过连接分数从-1到1进行评估：正分数表示化合物促进作用；而负分数表示化合物抑制作用。