RNA 16. SCI 文章中的融合基因之可视化

前言

上期我们聊了一下数据库，可以直接使用，但是有的时候我们还是需要对新数据进行融合基因的检测，一般来说 RNA 和 DNA 都可以做融合的检测，但是为什么官方更倾向基于 RNA 进行融合检测呢？

一、 融合基因检测

    我们先看融合基因示意图，例子选择的是血液病的融合基因 BCR-ABL，该融合是由于 9，22号染色体的易位，导致疾病的发生。

基因融合常见的三种发生机制：

1）Chromosomal Translocation，染色体易位。如下图A中1号和2号染色体上的两片段发生交叉互换，导致1号染色体上的浅绿色基因与2号染色体上的橘黄色基因融合到一起；

2）Interstitial deletion，中间缺失。如下图中，3号染色体上的橘黄色基因和浅绿色基因之间的区段发生缺失（deletion），最终导致这两个基因融合到了一起；

3）Chromosomal Inversion，染色体倒位。如下图4号染色体上的橘黄色基因到墨绿色基因之间的片段发生倒位，最终导致橘黄色基因和浅绿色基因融合到了一起。

二、 融合基因检测

基于高通量测序的融合基因检测主要包括以下三步：

先将reads通过STAR比对到参考基因组，筛选出split和discordant reads作为候选的融合基因序列；

将候选融合基因序列与参考基因序列进行比对，根据overlaps预测出融合基因；

对预测结果做过滤，去除假阳性结果。

    我们这里选择 Aviv Regev 实验室开发的 STAR-Fusion 软件，主要是因为这款软件后续也开发了一些可视化的软件，方便我们讲解。

1. 下载测试的数据

    我们首先下次测试数据，这个 STAR-Fusion 检测融合基因从原始的paried-end Reads 开始分析，

https://codeload.github.com/STAR-Fusion/STAR-Fusion-Tutorial/zip/refs/tags/v0.0.1

下载后，看下压缩包里面的文件，包括原始数据，测试的shell脚本以及基因组文件（.fa）和基因注释文件 (.gtf)

2. 软件安装

    软件包安装两种方式，一种 git 之间安装，但是这种需要考虑网速，另一种就是下载本地自己安装，make一下既可以。

Installing from GitHub Clone:

%  git clone --recursive https://github.com/STAR-Fusion/STAR-Fusion.git

b. Downloading a STAR-Fusion Release (Preferred)

Visit https://github.com/STAR-Fusion/STAR-Fusion/releases

下载之后解压 .tar.gz 文件, 进入目录，在 'make'，即可以完成安装。

3. 建立reference lib

    首先需要建立参考基因组对应的reference lib,  至少需要参考基因组对应的fasta文件和gtf文件，另外还可以提供已有的融合基因的注释等。

对于human和mouse而言，提供了已经构建好的文件，链接如下：

https://data.broadinstitute.org/Trinity/CTAT_RESOURCE_LIB/

文件目录如下：

建库如下：

FusionFilter/prep_genome_lib.pl \  --genome_fa ref_genome.fa \  --gtf ref_annot.gtf \  --fusion_annot_lib CTAT_HumanFusionLib.dat.gz \  --annot_filter_rule AnnotFilterRule.pm \  --pfam_db PFAM.domtblout.dat.gz

4. 软件检测过程

利用建好库，以及下载的fastq 文件既可以运行 STAR-Fusion，如下：

cd testing/STAR-Fusion --left_fq reads_1.fq.gz --right_fq reads_2.fq.gz \               -O star_fusion_outdir \               --genome_lib_dir  /path/to/your/CTAT_resource_lib \               --verbose_level 2

5. 结果输出

#FusionName           JunctionReadCount  SpanningFragCount  SpliceType           LeftGene                        LeftBreakpoint    RightGene                        RightBreakpoint   LargeAnchorSupport  FFPM        LeftBreakDinuc  LeftBreakEntropy  RightBreakDinuc  RightBreakEntropy  annotsTHRA--AC090627.1      27                 93                 ONLY_REF_SPLICE      THRA^ENSG00000126351.8          chr17:38243106:+  AC090627.1^ENSG00000235300.3     chr17:46371709:+  YES_LDAS            23875.8456  GT              1.8892            AG               1.9656             ["CCLE","FA_CancerSupp","INTRACHROMOSOMAL[chr17:8.12Mb]"]THRA--AC090627.1      5                  93                 ONLY_REF_SPLICE      THRA^ENSG00000126351.8          chr17:38243106:+  AC090627.1^ENSG00000235300.3     chr17:46384693:+  YES_LDAS            19498.6072  GT              1.8892            AG               1.4295             ["CCLE","FA_CancerSupp","INTRACHROMOSOMAL[chr17:8.12Mb]"]ACACA--STAC2          12                 52                 ONLY_REF_SPLICE      ACACA^ENSG00000132142.15        chr17:35479453:-  STAC2^ENSG00000141750.6          chr17:37374426:-  YES_LDAS            12733.7844  GT              1.9656            AG               1.9656             ["ChimerSeq","CCLE","Klijn_CellLines","FA_CancerSupp","INTRACHROMOSOMAL[chr17:1.60Mb]"]RPS6KB1--SNF8         10                 43                 ONLY_REF_SPLICE      RPS6KB1^ENSG00000108443.9       chr17:57970686:+  SNF8^ENSG00000159210.5           chr17:47021337:-  YES_LDAS            10545.1651  GT              1.3753            AG               1.8323             ["Klijn_CellLines","FA_CancerSupp","ChimerSeq","CCLE","INTRACHROMOSOMAL[chr17:10.95Mb]"]TOB1--SYNRG           8                  30                 ONLY_REF_SPLICE      TOB1^ENSG00000141232.4          chr17:48943419:-  SYNRG^ENSG00000006114.11         chr17:35880751:-  YES_LDAS            7560.6844   GT              1.4566            AG               1.8892             ["FA_CancerSupp","CCLE","INTRACHROMOSOMAL[chr17:12.97Mb]"]VAPB--IKZF3           4                  46                 ONLY_REF_SPLICE      VAPB^ENSG00000124164.11         chr20:56964573:+  IKZF3^ENSG00000161405.12         chr17:37934020:-  YES_LDAS            9948.269    GT              1.9656            AG               1.7819             ["FA_CancerSupp","Klijn_CellLines","CCLE","ChimerSeq","ChimerPub","INTERCHROMOSOMAL[chr20--chr17]"]ZMYND8--CEP250        2                  44                 ONLY_REF_SPLICE      ZMYND8^ENSG00000101040.15       chr20:45852970:-  CEP250^ENSG00000126001.11        chr20:34078463:+  NO_LDAS             9152.4075   GT              1.8295            AG               1.8062             ["FA_CancerSupp","CCLE","ChimerSeq","INTRACHROMOSOMAL[chr20:11.74Mb]"]AHCTF1--NAAA          3                  38                 ONLY_REF_SPLICE      AHCTF1^ENSG00000153207.10       chr1:247094880:-  NAAA^ENSG00000138744.10          chr4:76846964:-   YES_LDAS            8157.5805   GT              1.7232            AG               1.8062             ["FA_CancerSupp","CCLE","INTERCHROMOSOMAL[chr1--chr4]"]VAPB--IKZF3           1                  46                 ONLY_REF_SPLICE      VAPB^ENSG00000124164.11         chr20:56964573:+  IKZF3^ENSG00000161405.12         chr17:37922746:-  NO_LDAS             9351.3729   GT              1.9656            AG               1.9329             ["FA_CancerSupp","Klijn_CellLines","CCLE","ChimerSeq","ChimerPub","INTERCHROMOSOMAL[chr20--chr17]"]VAPB--IKZF3           1                  46                 ONLY_REF_SPLICE      VAPB^ENSG00000124164.11         chr20:56964573:+  IKZF3^ENSG00000161405.12         chr17:37944627:-  NO_LDAS             9351.3729   GT              1.9656            AG               1.8892             ["FA_CancerSupp","Klijn_CellLines","CCLE","ChimerSeq","ChimerPub","INTERCHROMOSOMAL[chr20--chr17]"]STX16--RAE1           4                  33                 ONLY_REF_SPLICE      STX16^ENSG00000124222.17        chr20:57227143:+  RAE1^ENSG00000101146.8           chr20:55929088:+  YES_LDAS            7361.719    GT              1.9899            AG               1.9656             ["FA_CancerSupp","CCLE","INTRACHROMOSOMAL[chr20:1.27Mb]"]AHCTF1--NAAA          1                  38                 ONLY_REF_SPLICE      AHCTF1^ENSG00000153207.10       chr1:247094431:-  NAAA^ENSG00000138744.10          chr4:76846964:-   NO_LDAS             7759.6498   GT              1.9086            AG               1.8062             ["FA_CancerSupp","CCLE","INTERCHROMOSOMAL[chr1--chr4]"]STX16-NPEPL1--RAE1    4                  24                 INCL_NON_REF_SPLICE  STX16-NPEPL1^ENSG00000254995.4  chr20:57227143:+  RAE1^ENSG00000101146.8           chr20:55929088:+  YES_LDAS            5571.0306   GT              1.9899            AG               1.9656             INTRACHROMOSOMAL[chr20:1.27Mb]RAB22A--MYO9B         6                  11                 ONLY_REF_SPLICE      RAB22A^ENSG00000124209.3        chr20:56886178:+  MYO9B^ENSG00000099331.9          chr19:17256207:+  YES_LDAS            3382.4115   GT              1.6895            AG               1.9656             ["FA_CancerSupp","ChimerSeq","CCLE","INTERCHROMOSOMAL[chr20--chr19]"]MED1--ACSF2           4                  11                 ONLY_REF_SPLICE      MED1^ENSG00000125686.7          chr17:37595418:-  ACSF2^ENSG00000167107.8          chr17:48548389:+  YES_LDAS            2984.4807   GT              1.9656            AG               1.9656             ["FA_CancerSupp","CCLE","INTRACHROMOSOMAL[chr17:10.90Mb]"]MED13--BCAS3          2                  12                 ONLY_REF_SPLICE      MED13^ENSG00000108510.5         chr17:60129898:-  BCAS3^ENSG00000141376.16         chr17:59469338:+  YES_LDAS            2785.5154   GT              1.5546            AG               1.9086             ["FA_CancerSupp","CCLE","INTRACHROMOSOMAL[chr17:0.55Mb]"]MED1--STXBP4          1                  15                 ONLY_REF_SPLICE      MED1^ENSG00000125686.7          chr17:37607291:-  STXBP4^ENSG00000166263.9         chr17:53218671:+  NO_LDAS             3183.4461   GT              1.3996            AG               1.7968             ["CCLE","FA_CancerSupp","Klijn_CellLines","INTRACHROMOSOMAL[chr17:15.44Mb]"]MED13--BCAS3          1                  12                 ONLY_REF_SPLICE      MED13^ENSG00000108510.5         chr17:60129898:-  BCAS3^ENSG00000141376.16         chr17:59465979:+  NO_LDAS             2586.55     GT              1.5546            AG               0.8366             ["FA_CancerSupp","CCLE","INTRACHROMOSOMAL[chr17:0.55Mb]"]STARD3--DOK5          2                  7                  ONLY_REF_SPLICE      STARD3^ENSG00000131748.11       chr17:37793484:+  DOK5^ENSG00000101134.7           chr20:53259997:+  NO_LDAS             1790.6885   GT              1.8892            AG               1.9656             ["FA_CancerSupp","CCLE","INTERCHROMOSOMAL[chr17--chr20]"]DIDO1--TTI1           1                  10                 ONLY_REF_SPLICE      DIDO1^ENSG00000101191.12        chr20:61569148:-  TTI1^ENSG00000101407.8           chr20:36642259:-  NO_LDAS             2188.6192   GT              1.6402            AG               1.9329             ["FA_CancerSupp","ChimerSeq","CCLE","INTRACHROMOSOMAL[chr20:24.85Mb]"]DIDO1--TTI1           1                  10                 ONLY_REF_SPLICE      DIDO1^ENSG00000101191.12        chr20:61569148:-  TTI1^ENSG00000101407.8           chr20:36634799:-  NO_LDAS             2188.6192   GT              1.6402            AG               1.8892             ["FA_CancerSupp","ChimerSeq","CCLE","INTRACHROMOSOMAL[chr20:24.85Mb]"]BRD4--RFX1            1                  8                  ONLY_REF_SPLICE      BRD4^ENSG00000141867.13         chr19:15443101:-  RFX1^ENSG00000132005.4           chr19:14109129:-  NO_LDAS             1790.6884   GT              1.9086            AG               1.8892             ["CCLE","FA_CancerSupp","INTRACHROMOSOMAL[chr19:1.23Mb]"]BRD4--RFX1            1                  8                  ONLY_REF_SPLICE      BRD4^ENSG00000141867.13         chr19:15443101:-  RFX1^ENSG00000132005.4           chr19:14094407:-  NO_LDAS             1790.6884   GT              1.9086            AG               1.8295             ["CCLE","FA_CancerSupp","INTRACHROMOSOMAL[chr19:1.23Mb]"]TRPC4AP--MRPL45       1                  8                  ONLY_REF_SPLICE      TRPC4AP^ENSG00000100991.7       chr20:33665849:-  MRPL45^ENSG00000174100.5         chr17:36478009:+  NO_LDAS             1790.6884   GT              1.6895            AG               1.9086             ["CCLE","Klijn_CellLines","FA_CancerSupp","INTERCHROMOSOMAL[chr20--chr17]"]

三、 可视化

基于STAR-Fusion结果，通过配套的FusionInspector进行过滤及整合；

FusionInspector  --fusions Sam_fusionList.txt \-O Sample  --genome_lib genome/genome \--left_fq clean/Sam.R1.fq.gz   --right_fq  clean/Sam.R2.fq.gz \--out_prefix finspector test --vis #输出可视化文件

获得输出文件：

finspector.fa : the candidate fusion-gene contigsfinspector.bed : the reference gene structure annotations for fusion partnersfinspector.junction_reads.bam : alignments of the breakpoint-junction supporting reads.finspector.spanning_reads.bam : alignments of the breakpoint-spanning paired-end reads.

1、 IGV

    IGV的使用网上有很多说明，有机会再给大家分享，IGV 输入文件包括：

reference file (.fa)：也就是参考基因组文件;

bed file (.bed)：参考基因结构注释文件; 

bam file (.bam)：过滤后的比对文件。

    如下官网说明：

finspector.fa : the candidate fusion-gene contigsfinspector.bed : the reference gene structure annotations for fusion partnersfinspector.junction_reads.bam : alignments of the breakpoint-junction supporting reads.finspector.spanning_reads.bam : alignments of the breakpoint-spanning paired-end reads.

IGV 显示出来结果还是很特别的效果，但是可以看到是两个基因的融合，如下：

2、 chimeraviz

    Bioconductor 包 chimeraviz 嵌合RNA可视化，一个自动整合RNA数据和已知基因组特征的可视化框架对于结果的检验是有帮助的。

    2017年发布的一个 bioconductor 包，chimeraviz 就可以做到自动创建嵌合RNA 可视化。官网教程，直接在 bioconductor 可以看到详细说明，下载安装好该R包后，自带一系列的融合基因可视化的测试数据。

https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/chimeraviz.html | HTML | R Script |

可以看到，所支持的9种融合基因检测工具的示例结果都在这里了，比如我最喜欢的 star-fusion 的结果节选如下：

[1] "5267readsAligned.bam"                                                [2] "5267readsAligned.bam.bai"                                            [3] "aeron_fusion_support.txt"                                            [4] "aeron_fusion_transcripts.fa"                                         [5] "chimericJunctions_MCF-7.txt"                                         [6] "defuse_833ke_results.filtered.tsv"                                   [7] "ericscript_SRR1657556.results.total.tsv"                             [8] "fusion5267and11759reads.bam"                                         [9] "fusion5267and11759reads.bam.bai"                                    [10] "fusion5267and11759reads.bedGraph"                                   [11] "fusioncatcher_833ke_final-list-candidate-fusion-genes.txt"          [12] "FusionMap_01_TestDataset_InputFastq.FusionReport.txt"               [13] "Homo_sapiens.GRCh37.74.sqlite"                                      [14] "Homo_sapiens.GRCh37.74_subset.gtf"                                  [15] "infusion_fusions.txt"                                               [16] "jaffa_results.csv"                                                  [17] "oncofuse.outfile"                                                   [18] "PRADA.acc.fusion.fq.TAF.tsv"                                        [19] "protein_domains_5267.bed"                                           [20] "reads.1.fq"                                                         [21] "reads.2.fq"                                                         [22] "reads_supporting_defuse_fusion_5267.1.fq"                           [23] "reads_supporting_defuse_fusion_5267.2.fq"                           [24] "soapfuse_833ke_final.Fusion.specific.for.genes"                     [25] "squid_hcc1954_sv.txt"                                               [26] "star-fusion.fusion_candidates.final.abridged.txt"                   [27] "star-fusion.fusion_predictions.abridged.annotated.coding_effect.tsv"[28] "UCSC.HG19.Human.CytoBandIdeogram.txt"                               [29] "UCSC.HG38.Human.CytoBandIdeogram.txt"                               [30] "UCSC.MM10.Mus.musculus.CytoBandIdeogram.txt"

3、 Circos

经典的Circos,可以清晰的展示染色体间和染色体内的基因的融合，我们这里同样使用 star-fusion 软件的结果，如下：

starFusion <- system.file(  "extdata",  "star-fusion.fusion_candidates.final.abridged.txt",  package = "chimeraviz")fusions <- import_starfusion(starFusion, "hg38", 10)plot_circle(fusions)

红色条带-染色体内融合，蓝色条带-染色体间融合，如下：

融合基因绘制

软件包 chimeraviz 自带绘图函数 plot_fusion，可以多角度的实现绘制融合基因，如下：

defuse833ke <- system.file("extdata", "defuse_833ke_results.filtered.tsv",  package = "chimeraviz")fusion5267and11759reads  <- system.file("extdata",  "fusion5267and11759reads.bam",  package = "chimeraviz")fusions <- import_defuse(defuse833ke, "hg38")fusion <- get_fusion_by_gene_name(fusions,"RCC1")fusion <- get_fusion_by_id(fusions, 5267)edbSqliteFile <- system.file("extdata",  "Homo_sapiens.GRCh37.74.sqlite",  package="chimeraviz")count <- system.file("extdata","fusion5267and11759reads.bedGraph", package="chimeraviz")edb <- ensembldb::EnsDb(edbSqliteFile)plot_fusion(fusion,#bamfile = fusion5267and11759reads ,            edb = edb,non_ucsc = T,            reduce_transcripts = T,bedgraphfile = count)

我们看到每种展示方式各有利弊，

1.IGV+FusionInspector：步骤繁琐，文件冗余较多；展示结果清晰明了；

2.chimeraviz ：自定义创建数据库文件有限制；支持多种融合分析内容输入，结果可视化类型丰富；

3.Circos：文件整理和conf比较繁琐；可视化结果自定义化程度高，较为美观。

利用了两期内容来阐述基于 RNA-seq 检测融合基因以及 SCI 文章中的一般展示方法，所以转录组的数据出来表达大家很熟悉之外，融合基因的分析也可以考虑分析一下，也许有意外的收获！

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References:

Haas B J , Dobin A , Li B , et al. Accuracy assessment of fusion transcript detection via read-mapping and de novo fusion transcript assembly-based methods[J]. Genome Biology, 2019, 20(1):1-16.

Lågstad S, Zhao S, Hoff AM, Johannessen B, Lingjærde OC, Skotheim RI. chimeraviz: a tool for visualizing chimeric RNA. Bioinformatics. 2017;33(18):2954-2956.

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