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A Guide to Using the Spatial Transcriptomics Spot Detector 2.0

Github上原文：https://github.com/SpatialTranscriptomicsResearch/st_spot_detector/wiki/ST-Spot-Detector-Usage-Guide

该工具允许通过平滑，整洁且直观的Web界面检测和导出ST数据集的点坐标，以正确可视化数据。

一、浏览器选择

需要具有HTML5支持的现代浏览器。Chrome，Firefox和Safari的最新版本应该可以使用。必须启用JavaScript。

二、实操

第一步：上传图片

注意：该工具已经过优化，可以处理直接从ST协议拍摄的图像。必须旋转图像，以使框簇( frame cluster )出现在图像的左上方。只要外部框架完好无损，也可以裁剪它们。将图像缩小到原始图像40％的图像可能有效，但不能保证提供结果。

1. 选择所需的Cy3荧光图像进行斑点检测。

2. 可选：如果需要组织检测，还可以上传HE明场图像（HE bright field image）。

3. 单击“上传图像”（由于所有计算和斑点检测将在后台执行，因此需要花费几分钟。STSpot检测器将显示正在执行的操作和剩余时间）。

   
   上传图像
   上传图像

第二步：图像对齐

注意：如果未上传HE图像和/或图像先前已对齐，则可以跳过此步骤。
此步骤中的思想是找到参考点（HE图像中的斑点或Cy3图像中的组织覆盖物），以便能够对齐两个图像。

1. 选定的图层调整：
   • 通过单击所需的层按钮来选择要调整的层（默认情况下为HE）
   • 单击鼠标左移选定的图层。
   • 用鼠标右键单击（或Ctrl +单击）平移图像。使用滚轮或缩放按钮进行缩放。
   • 选择要在“工具”中应用的变换类型（移动或旋转）。
   • 调整将会是分层的，可以禁用/启用它们。
   • 通过“调整”工具框添加调整（不透明度，亮度，对比度等），以便能够更好地查看参考点。

2. 完成后，单击斑点调整选项卡按钮（选项卡和笔图标）

   
   图像对齐

第三步：斑点调整

在此处，您可以删除错误检测到的斑点，手动添加未检测到的斑点，如果分配错误或将多个斑点分配给同一网格（阵列）位置，则可以更改任何斑点分配。网格显示为白色，您可以使用左下方的按钮在HE和Cy3图像之间切换。分配错误的点将带有红线。

斑点调整

1. 最初以半透明蓝色显示检测到的斑点。

2. 导航：

   • 使用Ctrl +左键单击在图像周围移动。使用滚轮或缩放按钮进行缩放。
   • 左击选择斑点。多个选择将被自动添加。
   • 右键单击或按“Clear selection”按钮取消选择斑点。
   • 使用“Delete selected spots”按钮删除选定的斑点。
   • 左键或右键单击可移动/定位斑点。

3. 如果已经上传了HE图像，则可以通过单击“选择组织内的斑点”按钮来自动选择组织边界内的斑点。

4. 可以通过单击“Add Spots”按钮并左键单击应放置的位置来添加缺失的斑点。通过单击“返回”按钮返回选择模式。

5. 通过使用"Edit assignments"按钮来更改斑点的分配。错误分配的斑点将带有红线。有时，在同一位置检测到多个斑点，因此必须将其删除，然后手动添加正确的斑点。有时，某个斑点的分配有误，因此可以在“Edit assignments”菜单中通过将其拖放到正确的位置来更改其分配。

6. 导出spot values:

• 单击“Data export”选项卡。
• 选择是导出所有斑点还是仅导出当前选择。
• 选择是否包括一个标志，该标志指示是否选择了导出（在tissue下面）。
• 单击“Export Spot Data”按钮。

• 单击“Export Alignment Matrix”按钮。

  
  Export the spot values

输出数据格式

导出的数据可用制表符分隔的文件格式设置，格式如下（对于选定位置）：

x   y   new_x   new_y   pixel_x pixel_y 

• x和y是原始点坐标
• new_x和new_y是相对于它们在数组中应具有的位置的数字。
• pixel_x和pixel_y是图像上该点的像素坐标。

或者，如果您选择包括选择标志，则格式为：

x   y   new_x   new_y   pixel_x pixel_y   selected_flag

如果仅导出选择内容，则不存在selected_flag。在所有斑点都已导出的情况下，如果已选择斑点，则标记为1；否则，标记为0。其他为0。

举个例子：
对于阵列中位于（3，4）的点，其x坐标实际上位于距离x坐标为的4附近10％的位置，而其y坐标位于y坐标为3的附近5％。在图像上，它位于像素处坐标510、780。

3   4   3.1 3.95  510   780

也可以导出包含3x3仿射变换矩阵(affine transformation matrix )的文件，该矩阵允许将数组坐标转换为像素坐标。该矩阵可用于将数据绘制到HE图像上。

a11 a12 a13 a21 a22 a23 a31 32 a33

每个元素对应于3x3仿射矩阵变换的一个细胞，以从数组坐标变为像素坐标

最后一步：数据转换和可视化

所选的点（例如在组织中）的导出的调整后阵列坐标可用于调整由ST管道生成的ST数据集。
ST Pipeline软件包的脚本“ adjust_matrix_coordinates.py” 可用于调整ST Pipeline（TSV格式的矩阵）的输出，如下所示：

adjust_matrix_coordinates.py --coordinates-file new_array_coordinates.txt \
    --outfile new_stdata.tsv --counts-matrix stdata.tsv

这将生成一个新矩阵（new_stdata.tsv），该矩阵仅包含ST点检测器ST Spots detector的输出中存在的点（以数组坐标表示）并具有已调整的坐标。

然后，可以使用3x3仿射矩阵文件通过ST Viewer、ST Analysis或您自己的脚本将数据绘制到组织图像（HE）上。

参考文章

• https://github.com/SpatialTranscriptomicsResearch/st_spot_detector/wiki/ST-Spot-Detector-Usage-Guide