2023-02-23 | 北极鹿科动物的生物适应性（驯鹿）
●英文题目：《Biological adaptations in the Arctic cervid, the reindeer (Rangifer tarandus)》
●期刊：SCIENCE
●影响因子：2022_IF=63.714；中科大类: 综合性期刊1区; 中科小类: 综合性期刊1区; JCR分区: Q1
●发文单位：西北工业大学、苏州大学、中国农科院特种动植物研究所、中科院水生生物研究所、挪威生命科学大学、中科院昆明动物所等多个机构
●文章作者：西北工业大学林则山、陈垒等为共同第一作者；西北工业大学邱强、王文（中国科学院昆明动物所）、中国农科院特种动植物研究所李志鹏等共同通讯作者
●摘要1：
引言：
驯鹿(Rangifer tarandus)自然分布在北极和亚北极地区。因此，这些动物已经进化到面临许多挑战，包括暴露在严寒中，冬季有限的食物供应，以及极长的光照或黑暗时期。与所有其他种类的鹿不同，雄性和雌性驯鹿每年都长出鹿角。此外，驯鹿是鹿科中唯一完全驯化的物种。然而，对于这些性状的潜在遗传原因知之甚少。
基本原理：
我们在驯鹿、其他反刍动物物种和一些哺乳动物外群之间进行了比较基因组学分析，以识别快速进化的基因、正选择的基因和驯鹿特异性突变。我们进一步对来自中国北方的3只国内驯鹿和来自北欧的3只野生驯鹿的基因组进行了重测序，以验证驯鹿特异性突变是固定在物种中的，而不是个体的多态性。为了支持我们的计算得出的见解，我们随后进行了体外功能实验，以探究一些驯鹿特异性突变基因可能产生的功能后果。
结果：
我们发现，在驯鹿中，参与维生素D代谢途径的两个基因（ CYP27B1 和 POR ）处于正选择状态。此外，我们的功能实验验证了这两种关键酶（ CYP27B1 和 POR ）与山羊和狍子中直系同源物相比表现出更高的催化活性。我们还发现了在脂肪代谢中发挥作用的基因中固定的驯鹿特异性突变，包括 APOB 和 FASN 。驯鹿 CCND1 基因上游的突变赋予了雄激素受体一个额外的功能结合基序，从而可能导致雌性鹿角的生长。在昼夜节律途径中，我们观察到8个基因有驯鹿特异性突变，其中4个基因正在快速进化。其中，驯鹿 PER2 中的Pro1172→Thr（P1172T）突变导致与 CRY1 的结合能力的丧失，从而导致昼夜节律失常。最后，我们在11个与神经嵴细胞的发育、迁移和分化相关的基因中发现了驯鹿特异性突变，这可能是驯鹿温顺的原因。
结论：
摘要1
●摘要2：
驯鹿是北极物种，表现出独特的生物学特征，其潜在的遗传基础在很大程度上仍然未知。我们将驯鹿的基因组与其他反刍动物和非反刍哺乳动物的基因组进行比较，以揭示轻度昼夜节律失常，高维生素 D 代谢效率，雌性的鹿角生长特征，温顺的遗传基础。我们验证了两个驯鹿维生素 D 代谢基因（ CYP27B1 和 POR ）显示出正选择的迹象，并且表现出比其他反刍动物更高的催化活性。驯鹿 CCND1 基因上游的突变赋予雄激素受体额外的功能性结合基序，从而可能产生雌性鹿角。此外，驯鹿 PER2 中的一个突变（脯氨酸-1172→苏氨酸）导致与 CRY1 的结合能力丧失，这可能解释了驯鹿的昼夜节律失常。
●前言：
驯鹿（Rangifer tarandus）自然分布在北极和亚北极地区。 他们面临的挑战如冬季严寒和有限的食物供应，在一年中长时间的光明和黑暗，因此必须发展策略来解决这些环境障碍。 例如，驯鹿不显示24小时的活动节奏，有证据表明，其昼夜节律组织薄弱甚至缺乏，表明它们的内部生物钟可能适应了北极的极端光周期。这些动物还发展出一种特殊的脂肪代谢过程，通过外周血管收缩限制热量损失，并保持较低的静息代谢率。另一个挑战是，尽管必须应对低水平的太阳能，驯鹿仍需要满足鹿角快速生长对 Ca 的需求，因此这意味着它们必须进化出特别高的维生素 D 代谢能力。此外，虽然考古证据表明人类开发鹿科动物已有数千年，但 R. tarandus 是鹿科 (Cervidae) 家族中唯一完全驯化的物种。在这方面，过去几个世纪出现的大规模驯鹿畜牧业对于亚洲和欧洲高北极地区人类文明的发展具有相当重要的意义。驯鹿在大型家养畜群中饲养，这些畜群在活动模式、驯服性和线粒体序列方面与其野生亲缘动物存在差异。然而，尽管结合了这些特征，但目前对其潜在的遗传原因知之甚少，这是我们在本研究中旨在解决的问题。
图1
●结果：
1、驯鹿基因组表现出维生素 D 特异性突变
尽管反刍动物是一个重要的陆生食草动物群，其成员已经适应了广泛的陆生栖息地，但 R. tarandus 是鹿科动物中唯一广泛分布于北极和亚北极地区的物种。由于雌雄驯鹿在长期处于低太阳能或无太阳能的地区栖息时都会长出大鹿角，因此可以想象该物种需要有效的钙代谢和再吸收。鹿血中活性维生素 D [1α,25-(OH)2D3] 的水平与鹿茸的生长速度有关。因此，我们从驯鹿参考基因组中得到了涉及维生素 D 代谢途径的所有 28 个基因，并将它们与来自我们反刍动物基因组计划 的其他反刍动物物种以及其他哺乳动物外群的直系同源基因进行了比较，包括猪 (Sus scrofa domesticus)、马 (Equus caballus)和人类 (Homo sapiens)。
我们发现两个基因( CYP27B1 和 POR )在驯鹿中处于正选择[系统发育分析中的分支位点模型，通过最大似然(PAML),卡方检验，P<0.05]（图1a)。 此外，6个基因( ACAT2、CYP51A1、EBP、CYP2R1、BK2和TRPV5 )显示出驯鹿特异性突变（图1A)，并且 APOB 被鉴定为一个快速进化的基因[PAML中的分支模型，卡方检验，P<0.05，较高的Ka/Ks比率（即每个非同义位点的非同义替换数与每个同义位点的同义替换数之比）]（图1A)。 为了探索这些等位基因是否在驯鹿中固定，我们对来自我国内蒙古自治区大兴安岭的3只驯鹿和来自挪威Snøhetta山区的3只野生驯鹿进行了重测序，发现所有7只个体的突变等位基因都是相同的。 请注意，下文所述的其他基因的所有突变也在所有七只驯鹿中固定。
CYP27B1 和 POR 是在触发维生素D活性1α,25-(OH)2D3中起关键作用的酶。 我们将驯鹿与其他反刍动物（包括现有的最接近的Cervid基因组，来自西伯利亚狍子（Capreolus pygargus)，GenBank Assembly：GCA 000751575.1)和外部类群进行了基因组比较，发现在 CYP27B1（图1b)和 POR 基因的三个位置上都有驯鹿特有的突变。 我们还利用Phyre2进行了3D结构模拟，以检查这些突变对酶结构的可能影响。 我们发现只有 CYP27B1 中的K282→N(K282N)突变与P450功能域接近（图1C)，而其他突变的氨基酸与P450功能域不接近（图1C）。 尽管这些突变既不位于已知的功能域内，也不靠近已知的功能域，但它们也可能影响催化活性。
为了探索这些突变的功能相关性，我们在体外合成了驯鹿、狍子和山羊（Capra hircus）的同源物，并通过测量由酶、底物和NADPH（NADP+的还原形式）组成的重组体系中的活性来测试它们的酶催化活性。 对于 CYP27B1 , 驯鹿蛋白变异体的代谢效率显著高于山羊和狍子蛋白（分别提高2倍和1.5倍；Ttest,P<0.01)（图1d)。 驯鹿 POR 的效率分别是山羊和狍子 POR 的20倍和6倍（图1E；t检验，P<0.01)。 这些结果表明，驯鹿比其他哺乳动物进化出了更有效的维生素代谢途径。 这一变化可能使驯鹿获得维持新陈代谢和钙吸收所需的高水平的活性维生素D，并促进在北极和亚北极地区生存所需的体脂氧化。 我们还注意到钙受体编码基因 TRPV5 的锚蛋白重复区（被活性维生素D激活从而影响钙的重吸收）表现出驯鹿特异性突变，这表明在驯鹿体内与维生素代谢相关的上、下游通路都发生了进化，以保证钙和能量的供应。
2、与脂肪代谢相关的驯鹿特异性突变
我们进一步确定了在脂肪代谢中发挥作用的基因中驯鹿固定的特异性突变。 这些基因包括参与低密度脂蛋白转运的ApoB和编码脂肪酸合酶的Fasn，脂肪酸合酶是从头脂肪生成的基本酶，这些基因以前在北极熊（Ursus maritimus；ApoB）和阿德利企鹅（Pygoscelis adeliae；Fasn）中都被报道为正选择的靶点。 尽管选择的位置与北极熊和阿德利企鹅不同，但这一观察表明，通过以物种特有的方式独立修饰关键脂肪代谢基因，脂肪代谢通路在同温极地动物中经历了趋同进化。
图2
3、与雌性角的生长相关的突变
据认为，鹿科动物鹿角的生长要么由雄激素驱动，要么由雄激素强调控。 值得注意的是，驯鹿是唯一雌性（图2a)和雄性都长鹿角的鹿科物种，与其他鹿种不同，出生后不久切除任何与性别相关的性腺并不妨碍鹿角的生长和随后的季节性更换。 因此，我们假设这种现象可能与某些调节鹿茸生长的基因对低水平雄激素的敏感性增加有关。 特异性的5'-TGTTCT-3'基序已被鉴定为哺乳动物雄激素受体结合位点。 因此，我们检查了与鹿科动物鹿角相关的30个高表达基因的启动子区，并确定了鹿角特异性 CCND1 基因上游的三个5'TGTTCT-3'基序（图2B），该基因调节细胞周期，是软骨细胞增殖所必需的，因此与鹿角生长密切相关（图2B）。 特别是，我们注意到驯鹿含有第三个驯鹿特有的序列。 为了验证雄激素受体在基因调控中的作用，我们采用染色质免疫沉淀结合定量聚合酶链反应（Chip-QPCR）测定了5只雌性驯鹿血液标本中雄激素受体与相关基序的结合能力。 三只雄性狍子作为对照。 结果表明，雄激素受体在驯鹿中与鹿角特异性 CCND1 基因上游的第二和第三个基序结合，而在狍子（图2C)中仅与第二个基序结合。 这些发现表明，在雄激素水平较低的情况下，这种额外的基序可能会增强 CCND1 的表达，从而使雌性驯鹿生长鹿角。
图3
4、北极光条件下的昼夜节律调节
驯鹿经历长期的日光波动和不同的季节与温带、亚热带或热带栖息地的鹿科动物不同。 环境对驯鹿昼夜节律的影响导致这些动物在冬季和夏季失去日常节律活动，并表现出不寻常的褪黑激素分泌的内部节律。 然而，鲁棒（稳健的）的生物钟丧失背后的遗传机制仍未解决。 在其他哺乳动物中，光调节下视交叉上核(SCN)中的生物钟--下丘脑无信号转导通路，通过光诱导的神经递质[PACAP（垂体腺苷酸环化酶激活多肽）和谷氨酸]改变Ca2+浓度，并触发cAMP反应元件结合蛋白(CREBs)的磷酸化（图3a)。 因此，我们在KEGG和Reactome数据库中检索了165个与昼夜节律途径相关的驯鹿基因，并在功能域( PER2、NOCT、GRIA1、GRIN2B、GRIN2C、ITPR3、ADCY5和NOS1AP )中发现了8个表现出驯鹿特异性突变的基因（图3A）。 此外，在确定为快速进化的四个基因( ADCY2、ADCY8、CAML4和CAMK2 )中，在 ADCY8 和 CAML4 中也观察到驯鹿特异性突变。
磷酸化的 CREB 激活转录周期( PER1、PER2和PER3 )和隐色素( CRY1和CRY2 )基因，这些基因是维持昼夜节律的中心元素。 在驯鹿的 PER2 基因中发现了3个驯鹿特异性突变； 其中，P1172T突变被预测，通过三维结构模拟，影响 PER2 和 CRY 之间的结合域（图3b)。 为了检验P1172T驯鹿特异性突变的效果，将T1172突变到相应的野生型(WT)氨基酸(P)，然后进行共免疫沉淀（CO-IP）实验。 虽然WT PER2(P1172,P型）与CRY1结合，但驯鹿突变的PER2(1172,T型）不能与CRY1结合（图3C)。 研究表明，PER2和CRY1的结合是外周组织和细胞中持续光诱导的昼夜节律所必需的，而CRY2只是适度地削弱节律。 这些结果表明，驯鹿P1172T突变导致了PER2与CRY1结合能力的丧失，从而导致了驯鹿昼夜节律失常。
在其他7个具有驯鹿特异性突变的昼夜节律基因中，NOCT基因在包括脂质代谢在内的许多代谢过程的昼夜节律控制中起着关键的转录后调节作用。 值得注意的是，我们在这个基因中观察到了几个驯鹿特有的突变（图3D)。 此外，在驯鹿特异性突变基因中，有3个基因(GRIA1、GRIN2和ITPR3)影响神经元细胞中的Ca2+浓度，另有4个基因(ADCY5、ADCY8、CAMK2和NOS1AP)影响CREB的磷酸化。 GRIA1和GRIN2基因编码谷氨酸受体，激活谷氨酸受体是将光信息传递到SCN的关键步骤。 ITPR3基因编码细胞内钙通道受体。 CREB通过ADCT介导的途径或CAMK2-、CALML4-、NOS1AP介导的途径被磷酸化。 这些结果表明，不仅驯鹿生物钟中的几个核心蛋白和基因发生了改变，而且它们相关的上游和下游通路也发生了变化，因此我们假设这些变化可能是促进驯鹿适应北极光照条件使其昼夜节律失常的重要组成部分。
图4
5、与驯鹿温顺性相关的突变
尽管大多数鹿科动物进化出敏感和警惕的行为来躲避捕食者，包括人类，驯鹿还是相当温顺的。 大约从第一个千年开始，驯鹿就被人类用来运输，作为诱饵动物，甚至用来挤奶。 这种驯鹿的温顺特性可能解释了为什么驯鹿是最成功的驯养鹿科动物。据推测，神经嵴细胞（NCCs）可能在驯化和驯化中发挥重要作用。 在猫（Felis Catus）和狗（Canis Lupus familiaris）中发现了支持这一假说的证据。 我们研究了与NCCs相关基因的驯鹿特异性突变，发现了11个与NCCs发育(MSX2、ID3、BCAT1、CAD6和CAD11)（图4）、NCCs迁移(TCOF1、BCAT1、NOTCH2和NOTCH3)和NCCs分化(COL2A1、KIT和SI)相关基因的驯鹿特异性突变（图4)。 此外，GEM和ASCL1分别被鉴定为与NCCs的发育和分化相关的快速进化基因。 与NCCs分化相关的COL2A1基因也在驯鹿中被正选择（图4）。 有研究报告了KIT基因的突变，这些突变与家猫、马和猪身上的白色斑点有关。 值得注意的是，白斑驯鹿通常表现出较高的温顺水平，即使当牧群的其他部分处于普遍兴奋的状态时，牧民也很容易接近它。 因此，我们推测这些特异的NCC基因突变可能与驯鹿特有的温顺特性有关。
