RNA-seq分析流程

1.使用trimmomatic去接头；

2.使用star对参考基因组构建索引（30min）；

STAR  --runThreadN 8  --runMode genomeGenerate  --genomeDir  $workingdir \

  --genomeFastaFiles  $ref --sjdbGTFfile    $gtf &

3.使用star将illumina测序数据比对到参考基因组上(1h);

    此时得到的bam文件处理后即可用IGV进行可视化，首先对bam文件进行sort并建立索引：

samtools sort -@ 30 $file -o $out

samtools index $file

4.使用featurecounts计算比对到每个基因上的counts，需要传入gtf注释文件；

featureCounts -Q 2 -M --fraction -s 0 -T 10 -p -C -a your.gtf -o $out.featurecounts $bam

5.使用TPM对counts进行归一化处理；

TPM计算脚本见：https://www.jianshu.com/p/d02334a98e0a，需要准备gtf格式的注释文件,counts文件和自己构建的样品分组文件。

6.可使用DEseq2或edgeR进行差异表达基因（DEGs）等分析。