CNV变异分析软件介绍之DECoN

CNV软件的介绍

最近在学习CNV检测软件，在查阅的时候发现有个软件比较测试的文章，大力推荐了DECoN，那我就去学习一下这个软件吧。
先说说这个软件的优点：

• 基于经典软件ExomeDepth，采用的是Read-Depth(RD)主流检测策略。
• 青出于蓝而胜于蓝，在ExomeDepth的基础上新增加了亮点，检测染色体上第一个外显子区域的变异
  和在隐马可夫模型中考虑了exon之间的距离这一因素。
• 基于NGS检测CNV，基于成本的因素，DECoN可以适用于exon-based的panel测序。
• 运行速度和存储消耗也有极大的优势，对于周期很短的临床检测样本，无疑是个很不错的选择。

文章链接：http://europepmc.org/backend/ptpmcrender.fcgi?accid=PMC5409526&blobtype=pdf

在准确性上，结果也很诱人，通过模拟数据和真实数据对软件的性能进行评估，在模拟数据集中，DECoN效果惊人，100%的灵敏度和99%的特异性。真实数据采用了illumina TruSight Cancer Panel测序的结果，最终鉴定出来24个exon CNV，用MLPA技术进行验证，有23个可以检测到，假阳性率4%。这个结果确实能压倒一大批的检测软件。

原理大家可以参考我前面写的简书，链接为https://www.jianshu.com/p/6301d9592d50。

CNV软件的安装。

接下来进行实际操作吧。哈哈，踩坑之后，才深感好看的玫瑰都是带刺的。

软件下载路径为：https://github.com/RahmanTeam/DECoN

docker安装方法见链接：
https://github.com/RahmanTeam/DECoN/pull/4/commits/74eec4176a48e0b1daded5e08e8292bf003137c7

我这边采用的是常规的git 安装。

git clone https://github.com/RahmanTeam/DECoN.git

官网上表示，R依赖包为3.1.2，对于其他的R，确实存在很多冲突，所以老老实实地安装3.1.2的包吧。报错信息如下。

image.png
R安装包下载路径为：https://cran.r-project.org/src/base/R-3/R-3.2.1.tar.gz。

接下来开始漫长的填坑环节了。
下载好后，目录如下，我安装的是Linux版本，因此进入该目录进行安装：

image.png

R安装好后，需要安装DECoN的依赖包，如果没有添加该版本R的环境变量的话，需要将下面的Rscript换成R-3.2.1版本的全路径Rscript。

image.png
安装包：

./setup.sh

你会发现，没有运行过久，就会缺包而运行程序退出。报错查看文件为：

image.png

其他包安装方法可以为：

source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite("Biostrings")
biocLite("IRanges")
biocLite("Rsamtools")
biocLite("GenomicRanges")
biocLite("GenomicAlignments")
install.packages("reshape")

缺什么包补什么包吧。

CNV软件的运行及测试。

安装好后，再进行分析。分析步骤比较简单。

• 第一步：读入并获得count矩阵。
  从原始数据得到比对后的bam文件之后，读入bam，注意文件夹里除了bam文件外还需要bai索引。这里的bam文件是bam文件集，包括实验样本和对照样本。
  脚本为：

/data/pipe_panel/software/R/R-3.1.2/bin/Rscript --default-packages=methods,datasets,utils,grDevices,graphics,stats ReadInBams.R --bams bam.list --bed target.bed --fasta ucsc.hg19.fasta -out results

bed文件的整理如下，该文件不需要表头。name表示基因名。

image.png

bam.list文件如下：

image.png

这个步骤是与参考基因组对比，将bed区域的深度从bam中提取出来，采用的函数为getBamCounts。并将结果存储为.RData格式。

在做第一步的时候发现，你只能在packrat包所在的目录下运行，无法在其他地方导入packrat包。这个是因为packrat并没有安装在R-3.1.2的library下，因此无法导入。为解决这个问题，可以在脚本中首行处将包的lib文件进行加载。另外，packrat::on需要加上全路径。
添加脚本如下：

.libPaths(c("/software/CNV/DECoN/Linux/packrat/lib/x86_64-unknown-linux-gnu/3.1.2", "/software/CNV/DECoN/Linux/packrat/lib-ext"))
packrat::on('/software/CNV/DECoN/Linux')

• 第二步：质检
  进行质量控制，检测coverage过度的exon区域，相关性较差的样本等，用法如下：

Rscript --default-packages=methods,datasets,utils,grDevices,graphics,stats \
    IdentifyFailures.R --Rdata results.Rdata \
    --mincorr 0.98 --mincov 100 --exons hg19.BRCA.exons.bed \
    --custom TRUE --out results.corr

这一步的bed需要表头，有5列，分别是Chr、Start、End、Gene、Custom.Exon，有标题。实际上就是可以自己定义哪个位置是哪个外显子。

• 第三步：检测CNV区域
  这里的hg19.BRCA.exons.bed和第二步的为同一个。

/data/pipe_panel/software/R/R-3.1.2/bin/Rscript --default-packages=methods,datasets,utils,grDevices,graphics,stats makeCNVcalls.R --Rdata results.RData --transProb 0.01  --custom TRUE --out result.call.cnv --plot All --plotFolder DECoNPlots --exons hg19.BRCA.exons.bed

但是也会出现报错，需要调整的地方为：
colnames(ExomeCount)[1:length(sample.names)+6]=sample.names
替换成：sample.names <- colnames(ExomeCount)[1:length(sample.names)+6]

• 第四步：结果解读
  xxx_all.txt和xxx_custom.txt文件都是汇总结果，但是custom文件是有我们自己定义的外显子信息，另外可查看图形结果，出来图的即为阳性CNV结果。结果如下所示：

image.png

上面的折线图展示的是基因上coverage的分布，灰色代表对照样本，蓝色代表实验样本；中间展示的是基因的名称，最下方的散点图代表观测值和期望值之间的比值，灰色区域代表95%置信区间，当比值显著偏离置信区间时，认为该区域存在拷贝数变异。上图所示的红点区域代表实际观测值小于期望值，说明发生了deletion。高于观察值则为insertion。

参考：
1：https://pzweuj.github.io/2019/05/21/DECoN.html
2：https://cloud.tencent.com/developer/article/1556107