根据甲基化引物定位PCR产物序列及基因组位置

已经写了两篇根据普通引物确定产物序列和位置的文章，那么如何根据甲基化引物确定产物位置呢？

甲基化测序因为使用重亚硫酸盐进行了转化，未甲基化修饰的C碱基转化为U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T，而甲基化修饰C碱基将保持不变。那么序列就发生了变化（正链序列众多C变为T，反链序列众多G变为A），甲基化引物是根据转化后的序列进行设计的。

那么甲基化引物就不能使用In-Silico PCR工具和IGV进行查找，主要原因就是参考序列的问题，两个工具都未提供甲基化转化后的参考序列，IGV也可以使用自己导入的参考序列，但是有些麻烦。

那么怎么解决这个问题呢？

这时只要将第一篇文章（https://www.jianshu.com/p/1873035b3789）中blast的参考基因组改为CT/GA转化的基因组即可：

如何进行基因组GA/CT转化：使用bismark甲基化比对软件包  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3102221/

安装好后使用相关命令bismark_genome_preparation：

bismark_genome_preparation命令

只使用此一步便可将原hg19参考基因组转化为两个参考基因组，CT转化的和GA转化的。

使用转化后的两个fasta，使用blastdb构建index：

makeblastdb -in hg19_genome_CT.fa -dbtype nucl -out hg19_CT_genome

makeblastdb -in hg19_genome_GA.fa -dbtype nucl -out hg19_GA_genome

然后继续使用第一篇文章中的blast命令分别将两个引物比对到两个转化后的参考基因组即可，后续的引物对挑选规则和普通引物一致。

那么甲基化引物的产物的定位问题也解决了！