群体遗传学习专题 一之群体遗传所用技术

简化基因组

技术说明：

简单来说，简化基因组就是利用某种方式，获取基因组上的部分片段，进行标记开发的技术。其基本思路都是在酶切之后，对酶切片段进行部分处理，再进行测序的技术

 

技术分类：

 RAD-seq：原始的RAD-seq技术。酶切后连接到P1接头，再利用超声波将酶切片段随机打断，随后连接到P2接头，然后进行测序。

GBS：将酶切片段直接连接到接头后测序

2bRAD：通过对IIB型内切酶酶切基因组产生的等长tag进行高通量测序。

ddRAD：通过双酶切的方式，筛选固定长度来选择合适大小的片段进行测序。

 

比较：

简化基因组技术比较

应用：

RAD-seq：需要高密度标记的研究；需要开发SSR分子标记和引物设计的研究；适用于复杂和大基因组以及无参考基因组

GBS：适用于大样本，复杂基因组

2bRAD：由于片段非常短，不适合用来做de novo的位点的鉴定，也不适合用于大的、复杂的、无参考的基因组

ddRAD：适用于大样本，复杂基因组

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全基因组重测序

简介：

全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位点（InDel）、结构变异位点（SV，Structure Variation）和拷贝数变异位点（CNV，copy number variation)。SBC将不同梯度插入片段（Insert-Size）的测序文库结合短序列（Short-Reads）、双末端（Paired-End）进行测序，帮助客户在全基因组水平上扫描并检测与重要性状相关的基因序列差异和结构变异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因预测。

 

原理:

提取基因组DNA后进行随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段，制备成文库，进行重测序。基于测序序列和参考基因组之间的比对，发现样品中的SNP。

 

测序深度和覆盖度：

测序深度：它是评价测序量的指标之一。指的是测序得到的碱基总量（bp）与基因组大小的比值。或者可以理解为被测基因组上单个碱基被测序的平均次数。比如某样本的测序深度为30X，意味着该样本的基因组上每一个单碱基平均被测序了30次。要注意的是，是平均，测序深度有最大和最小值的。

测序覆盖度：测序最终组装得到的结果占整个基因组的比例。例如一次基因组测序，覆盖度为98.5%，就说明该基因组还有1.5%的区域通过组装和分析无法得到。

两者关系：测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，而测序带来的错误率或变异检测（例如，SNP）假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。

 

应用：

可广泛应用于群体进化、变异检测、性状定位、遗传图谱构建、功能基因挖掘等研究。

 

相对于其他技术的优势和问题：

优势： 1.除了可以获得基因表达区的信息，还能获得内含子、基因间区域的信息。

             2.能够分析样品基因组中大片段的结构变异

问题： 1. 基因组测序产生的数据需精简化

             2.数据分析所用到的系统和软件普适性待提高

             3.操作产生的错误率有待降低，检出率有待提高

             4.测序样本受限问题有待解决

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基因芯片

简介:

基因芯片指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于 400 ）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于硅片、玻片 等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，与计算机的电子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。

 

原理:

基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。具体方法是将许多特定的寡聚核苷酸或DNA片段(称为探针)固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交，利用碱基互补配对原理进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面。

 

分类：

1)根据制作方法，可将基因芯片分为原位合成芯片与合成后点样芯片。前者利用光引导聚合技术或压电打印法进行原位合成寡聚核苷酸探针；后者主要利用微型机械点样法或化学喷射法将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器直接点在芯片片基上。

2)根据芯片上固定的探针数量，可以将基因芯片分为高密度芯片和中低密度芯片两类。高密度芯片上的探针数量从几万到上百万，主要是通过原位合成制备的寡核苷酸芯片，以及通过将数万个基因或者EST序列的PCR扩增产物直接点至芯片上制备的cDNA芯片。高密度基因芯片主要用于大规模的基因表达谱测定、药物筛选和新药开发、基因功能探索等方面。中低密度芯片中探针的数目一般在几十到几千不等，一般是通过合成后点样制备的芯片，主要用于基因突变分析、基因表达谱分析等领域。

3)根据芯片上探针的不同，可将基因芯片分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。①寡核苷酸芯片：用照相平版印刷术和固相合成术结合在基片上生成寡核苷酸。该技术是先在玻片上涂上光敏化学材料，盖上罩，根据所要合成的碱基序列决定罩的透光位点。光照局部产生去防护作用，用所需核苷酸冲洗玻片，该核苷酸即在去防护部位粘合于玻片。其主要特点是可按需要设计一定序列的寡核苷酸链。②cDNA 芯片：将特定的或文库的cDNA经PCR扩增后用机械手点到基片上。

4)根据芯片用途，可以将芯片分为基因表达谱芯片、测序芯片、诊断芯片等。

5)根据载体材料不同，可将基因芯片分为尼龙膜、玻璃片、塑料片、硅胶晶片、微型磁珠等。

 

主要技术环节：

1.    构建芯片方阵

a）制备探针：芯片的类型不同，制备探针的方法也不尽相同。如果是检测表达谱，需要从待检测样品mRNA或者总RNA中制备cDNA探针;如果是SNP检测，则需要从待检测样品DNA中通过PCR制备探针或者人工合成寡核苷酸探针。

b）片基处理：目前制备芯片主要采用表面化学的方法或组合分类化学的方法来处理片基，然后使DNA片段按顺序排列在芯片上。

c）点样：点样方法基本上可分为原位合成与微矩阵点样两大类。①原位合成是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。由于原位合成的短核酸探针阵列具有密度高、杂交速度快、效率高等优点，而且杂交效率受错配碱基的影响很明显，所以原位合成的DNA微点阵适合于进行突变检测、多态性分析、表达谱检测、杂交测序等需要大量探针和高的杂交严谨性的实验。②微矩阵点样法是将DNA或生物分子合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于芯片载体上。

2.    制备样品

生物样品是复杂的生物分子混合体，一般不能直接与芯片反应，必须将样品进行生物处理。对于基因芯片，组织中获取的DNA/mRNA样品必须通过扩增(PCR)以提高检测的灵敏度。

3.    杂交反应

样品与芯片的杂交反应中涉及的因素主要有杂交温度、杂交时间、杂交液的成分等。生物分子反应是生物芯片技术中除方阵构建外最重要的一步，其复杂的程度和具体控制条件由芯片中基因片段的长短和芯片本身的用途而定。如果是基因表达检测，反应时需要高盐浓度、低温和长时间。如果要检测是否有突变，因涉及单个碱基的错配，故需要在短时间内、低盐、高温条件下高特异性杂交。

4.    信号检测及分析

杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。 基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统或称缩微芯片实验室。

 

应用及面临的问题：

在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测等许多领域。还有基因表达检测、寻找新基因、DNA测序、基因突变和多态性分析以及基因文库作图等方面。

基因芯片技术仍然存在着许多难以解决的问题，例如技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较狭窄等问题。