运用Hi-C+ATAC-seq+RNA-seq+ChIP-seq

2019-03-11 本文已影响232人黄晶_id

前面我们分别介绍过了Hi-C、ATAC-seq、ChIP-seq技术，今天我们看一篇运用了Hi-C+ATAC-seq+RNA-seq+ChIP-seq组合技术的高分文章。
这篇文章采用三维基因组组合技术，对比基因敲除前后的三维结构、易接近性、组蛋白修饰、表达水平、表型变化，找准差异点进行分析并适当验证，最终发表在NG高分文章。他们的实验思路对自己的课题有没有点启示呢？

这是实验室有矿呀，用这么多技术？这要不投个高分文章都对不起花的那些钱~

背景介绍

胚胎干细胞能够分化为所有器官的细胞类型，这个过程需要转录因子、表观遗传调节因子和信号分子等复杂的相互作用，其精确的时空调控决定了干细胞的发育命运。染色质三维结构特征对于干细胞命运决定过程中的基因转录表达起着关键性的作用，包括二价启动子（bivalent promoters）的出现，即同时标记有激活转录的H3K4me3和抑制转录的H3K27me3组蛋白修饰。催化此修饰的甲基转移酶分别是MLL2复合体和多梳（Polycomb）复合体2（PRC2）。其同时缺失或突变后会造成胚胎发育缺陷或致死。

本文以小鼠胚胎干细胞为材料，综合研究了敲除甲基转移酶复合体亚基MLL2所引起的基因组三维结构（Hi-C）、染色质可接近性（ATAC-seq）、组蛋白修饰（ChIP-seq）、表达水平（RNA-seq）的改变。发现MLL2的缺失增加了Polycomb复合体的占位，重塑了远距离的互作和组蛋白修饰，减少了关键基因的转录水平，最终造成胚胎发育异常。

主要内容

1.reChIP-seq鉴定二价启动子

传统的ChIP-seq不能区分同一个核小体上的不同修饰，近期报道的Sequential ChIP-seq (reChIP-seq)（连续进行2次抗体富集）则可同时检测二价修饰。研究者在的小鼠ESCs细胞中分别使用H3K4me3和H3K27me3进行了ChIP-seq和reChIP-seq，最终共同鉴定出3868个二价基因，并在MLL2, 及PRC1的亚基SUZ12和RING1B处富集，二价TSS和non-TSS peaks均富集在MLL2, H3K4me3和H3K27me3，并用reChIP-qPCR进行了验证。

2.MLL2和H3K4me3限制局部的Polycomb在二价基因的占位

敲除MLL2后，H3K4me3特异性的在二价启动子上的标记显著减少，而H3K27me3、SUZ12和RING1B则显著增加。564个基因表达显著上调，744个基因显著下调。绝大多数下调的基因是二价基因，涉及减数分裂和神经元发育相关的MLL2的靶基因，其它非二价基因的表达水平则较稳定。RNAPII-Ser5P在二价基因TSS位点的占位也显著减少。

3.Hi-C发现敲除MLL2引起A to B compartment的重塑

敲除MLL2后，分析基因组的三维高级结构，发现TAD平均大小、边界强度、以及CTCF的占位均没有发生大的改变。

然而，compartment则发生了一些转变，有3%的区域由A区转为了B区，有1.36%的区域由B区转为了A区。作者分析了这些转换的区域，发现二价基因越多的区域，发生A to B转换的比例越高，只有3条染色体(Chr7, Chr8, Chr14)中的B to A的转换更多。

在A to B的区域中含有148个二价基因，包括一些重要的发育调控基因Hand2，Neurog2，Prdm6，Hoxd等，这些基因的表达水平倾向下调。

4.Hi-C发现敲除MLL2引起二价启动子间的互作改变

分析TSS位点上下游250kb的区域，发现二价基因与其下游的区域互作频率更高，而仅有H3K4me3标记的区域则与其上下游均存在较为频繁的互作，提示MLL2的敲除可能引起二价基因TSS与上下游互作模式的改变。

分析后发现果然如此，野生型细胞中二价基因间的互作集中在TSS附近，而敲除MLL2后，这些互作则向上下游扩散，变得更加广泛，非二价基因间的互作仍集中在TSS附近。

在MLL2无催化活性的小鼠ESCs（catalytically dead MLL2 ESCs，MLL2CD）中进行原位Hi-C同样发现了这些现象，说明MLL2的催化活性促进了二价基因在TSS附近集中互作的模式。

5.ATAC-seq发现敲除MLL2引起二价启动子区的可接近性减少

在野生型细胞共鉴定出59,008 accessible peaks，而在敲除MLL2的ESCs中peaks数则减少为51,530。其中1258个基因由于TSS区域可接近性的减少而发生表达量下调，这些基因在神经元发育功能中富集。敲除MLL2特异性引起了二价基因的可接近性减少，而不影响非二价基因可接近性。