小RNA数据分析-第二步

上次讲到sRNA数据如何去接头，那么接下来的常规操作是什么？

流程图

一、去冗余（collapse）--- 用于比对的数据是否需要去冗余

作用：将相同reads合并，记录相同reads出现的次数

fastx_collapser -iSRR4010495_trimmed.fa -o SRR4010495_mc.fa

去冗余后的数据形式

去冗余后文件

“-”之前为编号，“-”之后为该read的丰度

当然也可以用CJ的TBtools来操作这一步：

java -cpTBtools_JRE1.6.jar biocjava.sRNA.Tools.sRNAseqCollasper --inFxSRR4010495_trimmed.fa --outCollaspedFa SRR4010495_mc.fa

Note：一般情况下去冗余这一步只在后续进行miRNA挖掘即预测phasiRNAs用到，用IGV查看的数据不需要去冗余，IGV需要展示每一条reads

是否去冗余对于查看IGV的影响如下：

去冗余

上图为去冗余后的数据产生的比对文件

未去冗余

上图为未去冗余的数据产生的比对文件

IGV对比

去冗余后的数据reads覆盖度明显降低

二、将未去冗余的数据回帖到基因组

建bowtie索引

bowtie-build -fFragaria_vesca.genome.fna Fragaria_vesca

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bowtie  -a -m 50 -v 0 -p 12 -f -S Fragaria_vescaSRR4010495_trimmed.fa SRR4010495.mapping.sam

#同一品种错配数为0；同一物种不同品种允许错配数为1，考虑到SNP的存在；

三、比对文件排序建索引

sambamba view -f bam-S SRR4010495.mapping.sam -o SRR4010495.mapping.bam -t 10

sambamba sortSRR4010495.mapping.bam -o SRR4010495.mapping.sorted.bam -t 10

sambamba indexSRR4010495.mapping.sorted.bam

sambamba相对于samtools更快

四、将比对文件加载到IGV查看sRNA数据

导入基因组文件和*.sorted.bam和*.sorted.bam.bai文件

sRNA数据可能会看到以下几种情况：

1、产生miRNA的区域

这个区域有两个产生于同一条链（红色：+；蓝色：-）的独立峰，两个峰之间无其他杂峰，高峰为miRNA的成熟序列reads，低峰为miRNA的star序列reads；

右键高峰reads----Copy

read sequence----miRBase中进行序列比对确认该miRNA是否有注释

产生miRNA的区域

2、产生phasiRNAs的区域

这个区域包含两条链产生的reads，且产生的reads以较为整齐的21nt，21nt相位切割的形式呈现；

用IGV的Define a region of interest工具选取PHAS区域及其前后各100bp的序列----psRNATarget预测该PHAS的trigger----Swissprot库比对查看该PHAS的注释

产生phasiRNAs的区域

3、重复序列区域

基因组中有大量的重复序列，这种区域产生的reads多为24nt，因此sRNA测序数据数量最多为24nt的reads；这个区域的reads通常没有相位切割的规律，以“一片云”的状态呈现

重复序列区域