WB中无法忽视的一步——总蛋白定量

想要验证细胞裂解是否成功？

进行总蛋白定量吧！

想将多个样品进行平行实验比较/标准化保存？

还是进行总蛋白定量吧！

进行总蛋白定量的方法多样，为了提高准确率，不浪费样品，对于每种分析方法的兼容性，我们都有必要评估检测样品的类型，检测范围和样本量，是否有合适的分光光度计，以及每个检测所需的时间和成本。

下表总结了常用的总蛋白定量分析方法

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今天，我们详说常用的Bradford和BCA法

1Bradford法

实验准备

考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后会变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速。结合物在室温下1h内保持稳定，如果样本数量较多就要把握好时间哦。

Bradford法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

实验准备

（1）考马斯亮蓝试剂：

100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。

（2）标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。

（3）器材：

酶标仪；旋涡混合器 。

具体操作过程

1用天平称量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去离子水中，配成100ml的溶液，溶液的浓度为10mg/ml。用磷酸缓冲溶液（PBS）作稀释液配备一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的BSA溶液。另外量取1ml的PBS溶液（BSA溶液浓度为0mg/ml）作对照试验。

2用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200ul的考马斯亮蓝（CBB）。静置10min后，用酶标仪测得这组BSA溶液的吸光度。以A595nm为横坐标，标准蛋白含量为纵坐标，在坐标轴上绘制标准曲线。

3加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。    

2BCA法

实验原理

二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的BCA Solution A(含有BCA)相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

实验准备

（1）BCA试剂的配制：

● 试剂 A 1L:

分别称取10g BCA (1%)；

20g Na2CO3·H2O(2%)；

1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)；

4g NaOH (0.4%) ；

9.5g NaHCO3(0.95%) ，

加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。

● 试剂 B  50ml:

取2g CuSO4·5H2O(4%)，加蒸馏水至50ml。

● BCA试剂:

试剂 A与试剂 B以50:1混合均匀。此试剂可稳定一周。

（2）标准蛋白质溶液:

称取0.5g牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成5mg/ml的溶液。用时稀释十倍。

（3）器材：

酶标仪；旋涡混合器 。

具体操作过程

1取96孔酶标板，按下表加入试剂。

2上述试剂加完后，准确吸取20μl样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200μl，轻摇，于37℃保温30-60min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上590nm处比色。

3以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。

总蛋白定量的实验方法并不困难，主要是要做好试剂的配置以及时间的把控，祝大家都能顺利的完成这重要的一步！