文献学习068--[SPP1 MP]胞外钙信号促进单核细胞向SP
今年1月份发表在Cell Death Dis (IF: 9.685)上的文章
1. Danger signal extracellular calcium and CPPs induce differentiation of monocytes into macrophage-like cells
作者此前的研究显示在LPS存在的情况下，胞外钙浓度的增加可以作为danger signal激活NLRP3炎症小体和细胞焦亡。Here we show that the danger signal extracellular calcium induces macrophage differentiation and survival when LPS is absent.
Fig 1a-c：在胞外钙浓度增加的情况下，单核细胞分化成macrophage样细胞 (calcium-macrophages)。当不存在其他survival factors，只有FCS- supplemented culture media时，培养的细胞会在2天左右死亡。与“煎蛋状”的GM-CSF-macrophages和M-CSF-macrophages相比，calcium-macrophages呈“needle-like shape”。
Fig 1d：和M-CSF-macrophages的多核相比，calcium-macrophages与GM-CSF-macrophages一样，主要是单个核。
Fig 1e：没有calcium or growth factors的单核细胞在两天内死亡。在钙诱导单核细胞分化的第二天，活细胞比例为57.0% ± 5.3（GM-CSF-macrophage cultures: 97.0% ± 0.8； M- CSF-macrophage cultures: 96.0% ± 0.3）。在第七天时，所有的培养方式都有大于97%的巨噬细胞存活率。
Fig 1f：为了探究CaSR在calcium- macrophages分化中的作用，作者使用了CRISPR-Cas9构建的CaSR-deficient monocytic THP-1细胞系。结果显示CaSR-deficient monocytic THP-1细胞对胞外钙信号增加的敏感性下降，细胞分化减少。
在此前的研究中，作者发现RA患者的单核细胞表达CaSR增加。
Fig 1g：Accordingly, 和正常相比，RA患者的单核细胞分化成的calcium-macrophages， elongation factor更高。
此前的研究显示，胞外钙离子的增加引起CPPs (composed of calcium, phosphate, and fetuin-A) 的合成增加，CPPs可以通过calcium-induced macropinocytosis被单核细胞摄取。为了探究CPPs对calcium-macrophages分化的影响，CPPs也被用于诱导巨噬细胞分化。
Fig 1h：CPPs induce the differentiation of calcium- macrophages when the uptake of CPPs by macropinocytosis was facilitated by the presence of calcium.
2. Calcium-macrophages are different from GM-CSF- macrophages and M-CSF-macrophages
为了探究calcium-macrophages 和 GM-CSF 以及M-CSF-macrophages相比的异质性，作者对这三种细胞进行了CITE-seq测序。
Fig 2a-b：一共得到了16470个巨噬细胞(4362 calcium-macrophages, 6588 GM-CSF-macro- phages, 5520 M-CSF-macrophages)，分为11个细胞群。结合蛋白标签，可知clusters 2, 5, 和 11 是calcium macrophages；clusters 1, 4, 和 9 是 GM-CSF- macrophages；clusters 3, 6 和7 是 M-CSF- macrophages. Clusters 8 和 10 并没有 mapped 到上述三类细胞。而且UMAP降维结果显示，calcium- macrophages和另外两种细胞存在较大转录差异。
Fig 2c-f：展示了每群的marker基因。calcium macrophages高表达SPP1。而且f图的结果显示，calcium macrophages和其他两类巨噬细胞存在完全不同的表达模式。
calcium macrophages的TREM2也是高的啊，感觉比SPP1更特异。
为了进一步探究calcium macrophages分化过程中的基因表达模式，作者进行了DNA microarray analysis (n = 4)。
Fig 2g-h：结果显示：最显著的基因表达变化发生在分化起始的前两天。pca的结果也显示在day-1和其他的差异最大，day-2 到 day-7的转录模式则更为类似。
Fig 2
因为作者测的是CITE-seq，前面分析了单细胞的转录差异之后，作者又分析了蛋白差异。
Fig 3a：同样的，calcium macrophages和其他两组存在明显蛋白表达差异。
Fig 3b-e：分别是GM的上调基因、M的上调基因、Ca和GM相比的上调基因及Ca和M相比的上调基因。
Fig 3f-h：calcium macrophages显著上调的蛋白包括FABP4, FABP5和SPP1。
Fig 3i：Resting calcium-macrophages 可以分泌高浓度 SPP1/ Osteopontin, 而RA patients的 calcium-macrophages 产生了更高浓度的 SPP1/Osteopontin。
SPP1/Osteopontin can be modified by thrombin cleavage which exposes an epitope for integrin receptors
Fig 3j：F2/ prothrombin也是上调的top30蛋白之一(e)，在calcium-macrophages中显著上调。
Fig 3k：一致的，cleaved SPP1/Osteopontin在calcium-macrophages的培养上清中被检测到，而且在RA calcium-macrophages的上清中浓度更高。
Fig 3l：此外，CD44 (SPP1/Osteopontin的受体)也显著上调(e)，在calcium-macrophages中显著上调。
Fig 3
3. Calcium-macrophages have a pro-inflammatory and migratory phenotype
为了探究calcium-macrophages 在激活后更像GM- CSF-macrophages 还是 M-CSF-macrophages，作者使用LPS诱导巨噬细胞活化。
Fig 4a-d：LPS促进了多种促炎性细胞因子的表达。
随后作者对LPS-stimulated macrophages进行了蛋白质组学分析。结果显示LPS-activated calcium-macrophages和另外两种巨噬激活后存在显著差异，更高的表达各种促炎因子和趋化因子比如IL1A和IL1B。
We have previously shown that LPS together with the danger signal extracellular calcium activates the NLRP3 inflammasome, which leads to the secretion of IL-1β and IL-18.
Fig 5a-e：和control相比，激活的calcium-macrophages产生更高的促炎因子IL-1β, IL-1α, 和 IL-18。而抑炎的IL-1RA 和 IL-18bp 则产生较低。RA calcium-macrophages responded with an even higher pro- inflammatory and a lower anti-inflammatory cytokine production compared to healthy donors
Fig 5f-g：Both anti-inflammatory cytokines were also secreted by resting calcium-macrophages.
Fig 5h-i：和control相比，calcium-macrophages 还产生更高水平的PGE2和COX2。
Fig 5j-m：划痕实验显示RA calcium-macrophages的迁移潜能更高。
4. Calciprotein particles are not degraded in the lysosomes
单核细胞摄取 CPPs 是通过 calcium-induced, CaSR-依赖性 macropinocytosis (巨胞饮)。而CaSR-deficient THP-1由于不能感受钙离子因而不能发生macropinocytose CPPs。
Fig 6a：PMA是macropinocytosis的诱导剂，PMA诱导下，CaSR-deficient THP-1通过macropinocytosis 对 CPPs 进行吞噬时，elongated calcium-macrophages被检测到 (和没有PMA相比)。
Fig 6b-d：Macropinosomes fuse with lysosomes to initiate degradation of macropinosome content. 作者使用 lysotracker 对lysosomes进行染色，calcein-labeled CPPs和lysosomes的共定位仅在一小部分CPP阳性的单核细胞中检测到。
为了分析单核细胞溶酶体中蛋白的降解，作者使用了DQ-BSA。
DQ-BSA染料：一种被荧光染料标记的自淬的蛋白质，一旦进入溶酶体，DQ-BSA就会被溶酶体蛋白酶裂解，导致荧光片段的不淬灭和释放，发出明亮的荧光。因此，DQ-BSA可用来指示溶酶体的功能是否正常。
Fig 6e-g：结果显示仅有一小部分的CPP+单核出现了DQ-BSA的阳性，而CPP-单核则有很多出现了DQ-BSA的阳性。calcein-labeled CPPs 和 DQ-BSA共定位分析显示most of the DQ-BSA was found not to be co-localized with CPPs。
最近有研究显示CPPs可以增加 the fused endosomes/lysosomes 的PH，因此 pH-sensitive dyes 比如 lysotracker 不适合于这种情况下的lysosomes检测。
Fig 6h-j： indeed, lysotracker fluorescence was reduced
Fig 6k-m： 而pH-依赖性 LAMP2 溶酶体染色在calcium-stimulated monocytes增加，提示钙离子引起 fused endosomes/ lysosomes的PH增加和lysosome content增加。
为了分析calcium-macrophages的溶酶体PH，作者使用了LysoSensor dye.
Fig 6n-o： 和预期一致，calcium-macrophages的平均荧光强度下降。
当 CPP 存在时，DQ-BSA 不降解，并且calcium- stimulated monocytes的fused endosomes/lysosomes 中 pH 值升高表明 CPP 和所含的胎球蛋白 A 无法降解，这可以引起溶酶体应激。 如果在巨胞饮作用后胎球蛋白-A 确实没有被降解，它应该仍然存在于分化的巨噬细胞中 7 天。
Fig 6p： 果然，calcium-macrophages的bovine fetuin-A比对照要高。
5. Disruption of lysosomal homeostasis induces TFEB and STAT3 transcription factors
众所周知，溶酶体稳态与雷帕霉素机制靶点（mTOR）途径相关，当溶酶体功能正常时，转录因子EB（TFEB）以mTORC1依赖性方式磷酸化并保留在细胞质中。 当溶酶体功能受损时，mTORC1 失活，未磷酸化的 TFEB 易位进入细胞核并启动溶酶体蛋白的表达。
Fig 7a： 作者发现，和control相比，calcium-macrophages的mTORC1, S6 ribosomal protein (S6rp)和 ribosomal protein S6 kinase (p70S6K)的磷酸化/活化显著下降。提示calcium- stimulated monocytes中mTORC1未活化。
Fig 7b, c： 一致的，calcium- stimulated monocytes中TFEB的核转位增加。
Fig 7d-e： TFEB的靶基因分析显示在分化成calcium-macrophages过程中，CLEAR (Coordinated Lysosomal Expression and Regulation) 基因网络显著上调，而且其上调在分化后7天也仍然存在。STAT3-signaling对于调节溶酶体平衡至关重要。底物超载促进溶酶体蛋白的 STAT3 依赖性转录，包括组织蛋白酶 B/D，作者发现其在 TFEB 靶基因中上调。
Fig 7f, g：使用 ImageStream 分析 STAT3 的细胞内定位表明存在钙诱导的 STAT3 核转位。
Fig 7h：为了测试 TFEB 或 STAT3 是否参与钙诱导的溶酶体增加，使用了 mTOR 激活剂 MHY1485（以促进 mTORC1 依赖性 TFEB 磷酸化和胞质溶胶保留）和 STAT3 抑制剂 S3I-201。 两者都导致抑制钙诱导的 LAMP2-荧光增加，提示转录因子TFEB和STAT3都参与溶酶体蛋白表达和生物合成。
Fig 7i：在 THP-1 钙巨噬细胞分化模型中，mTOR 激活剂 MHY1485 对 TFEB 核转位的抑制导致部分抑制，而 S3I-201 对 STAT3 的抑制完全减弱了钙巨噬细胞分化。
Discussion
该研究表明，细胞外钙浓度的增加会导致 CPP 的形成和摄取，以及随后单核细胞分化成巨噬细胞。值得注意的是，这个过程不需要额外的生长因子，如 GM-CSF 或 M-CSF。 钙巨噬细胞具有独特的形态表型，它们分化成needle like cells。 尽管 M1/M2 模型已经过时 ，但作者在 GM-CSF 巨噬细胞中检测到更多的促炎细胞因子和更少的抗炎 IL-10，而不是在 M-CSF 巨噬细胞中，两者分别类似于“促炎 M1”巨噬细胞 和“愈合M2”巨噬细胞。scRNA-seq、DNA 微阵列、蛋白质组学和功能分析结果显示，和对照巨噬细胞相比，钙巨噬细胞显示出独特的表型。 这种表型的特征包括needle like shape、过度的组成型 SPP1/骨桥蛋白产生、强烈的促炎细胞因子产生、抗炎介质分泌的缺乏以及明显的迁移潜力。 从 RA 患者的单核细胞中分化出来的钙巨噬细胞显示出这种表型的整体更强的表现。
