高滴度反转录病毒和慢病毒载体的制备

一、试剂

CaCl2溶液( 2mol/L )、完全培养基、DMEM 培养基、乙醇（或异丙醇） (70% )、胎牛血清( FBS )、HBS 溶液(2X)、HEPES (2.5mmol/L, pH 7.3)、OptiMEM+ 1 ％青霉素／链霉素( P/S )、OptiMEM , 无P/S、pCMVDΔR8.91 质粒、pUMVC 质粒、pVSV- G 质粒、喷雾瓶、293T 细胞、穿梭慢病毒载体质粒、胰蛋白酶EDTA ( 0.05%)

二、设备

小型台式离心机、生物安全柜、漂白剂( 14% )、细胞培养箱( 37 °C )、无菌锥底管( 15mL 和50mL )、培养皿( 150mm )、血细胞计数器、恒湿细胞培养箱（37℃, 5% CO2)、冰和冰桶、带有无菌滤芯(sterile barrier ) 吸头的微量移液器( 20μL 、200μL 和l000μL)、PVDF （聚偏二氛乙烯）、 Durapore 过滤装置( l50mL, 0.45μm 孔径）与真空管、SW32 或SW28 转子、试管架、无菌试管(0.65mL)、SW32 或SW28 转子的超速离心机( Beckman )、一次性超透明圆底管( 25mmX 89mm; Beckman)、UV 光源、涡旋仪

三、方法

转染用293T 细胞平板接种

1 将293T 细胞接种于150mm 平皿的20mL 完全培养基中， 37 °C 、5%CO2恒温细胞培养箱培养，每3 或4 天1 : 10 传代细胞。

2 转染前1 天，弃完全培养基， 用l0 mL PBS 洗涤细胞， 弃PBS 后加入5mL0.05 ％胰蛋白酶－EDTA 。室温放置5 ~ l0min ，来回摇动平板直至细胞脱离板底。加入5mL 完全培养基中和胰蛋白酶，然后用力吹打，使胰蛋白酶－EDTA 溶液击打板底，产生单细胞悬液。将细胞悬液转移到50mL 锥底管中。

3 使用血细胞计数器计算悬浮液中细胞浓度。一个150mm 平皿中293T 细胞汇合约为60 X 106~80 X 106个细胞。

4 将21 X 106个293T 细胞接种于37 °C 预热的150mm 平皿中20mL 完全培养基中。轻轻来回倾斜摇动平皿使细胞均匀分布，然后将平皿置于37 °C 细胞培养箱中过夜。准备5 个平皿。当准备多个平皿时， 计算150mm 平皿所需细胞悬液体积，然后制备终浓度为4.2 X 106个细胞／mL 的细胞悬液。每平皿加入15mL 完全培养基，再加5mL 细胞悬液。如上述均匀地分散细胞。

慢病毒载体和辅助质粒共转染293T 细胞

5 第1 天， 转染前2~ 4h, 将所有平皿的培养基更换为20mL 新鲜完全培养基， 37 °C预热。

6. 准备以下2 个试管，即足够转染5 个150mm 平皿的DNA 。使用带有无菌滤芯的吸头降低污染风险。

i. 管1: 混合DNA （无菌15mL 锥底管中）

7 用70％乙醇彻底喷洒涡旋仪，用纸巾擦拭，将其放入生物安全细胞培养柜中。

8 高速涡旋管2 的同时，在1 ~ 2min 内，逐滴地向管2 中加入管1 的混合液。室温下孵育20 ~ 30min 。

9. 加入1.56mL 步骤8 中的转染溶液至每个150mm 平皿中（步骤5 中制备） 。轻轻来回倾斜摇动平皿使细胞均匀分布，然后将平皿放回37°C 细胞培养箱中孵育过夜。

10. 第2 天早晨，弃培养液，用15mL 、37 °C 预热的DMEM 清洗细胞2 次。尽可能除去洗涤液。

11 将37 °C 预热的含1% P/S 的15mL OptiMEM 加入细胞培养皿中。再将细胞培养皿放回37 °C 细胞培养箱。

收获慢病毒载体上清

12 第4 天上午，将所有培养皿中的培养基转移到2 个50mL 锥底管中，盖紧盖子，并喷洒7 0％乙醇，从生物安全柜中取出。

13. 4 ℃ 、500g 离心50mL 锥底管l0min, 弃细胞。

14 将上清液转移到150mL 、0.45μm 孔径的PVDF 过滤装置中，并与抽真空装置连接。收集病毒滤液（约70mL ) ，冰上放置。

15 此刻，慢病毒载体上清的滴度应为106~ 108个转导单位( TU ) /mL , 这取决于载体和转入基因。如果滴度满足所需，则可分装慢病毒载体上清液并储存于-8 0℃ 。否则立即继续浓缩步骤。

超速离心浓缩漫病毒栽体上清

16 打开SW32 桶，桶置于管架上， 盖内侧朝上，以确保其充分暴露在紫外线下。在生物安全柜中用紫外线照射桶和盖10~ 20min, 或者使用70％乙醇处理桶和盖20 ~ 30min 。风干桶和盖，除去乙醇。

17 . 将2 个25mmX 89mm 超离心管放置架上，加满7 0％乙醇，处理20 ~ 30min 。

18 . 倒出7 0％乙醇。用连接抽真空装置的无菌巴斯德移液管尽可能去除乙醇。用无菌PBS 洗涤离心管2 次。

19 将步骤14 得到的7 0mL 过滤的慢病毒上清平均分配在SW32 桶中，盖紧后从生物安全柜中取出。桶在冰上放置10min 。此外，浓缩慢病毒载体上清的前一天晚上，将SW32（或SW28) 转子4 °C 放置。否则，超速离心机需要相当长的时间使巨大的转子降温。

20 使用SW32 或SW28 转子，离心管在4 °C 下、28000r/min 离心75min 。

21 从转子中取出筒，并将其放置在冰上。70％乙醇喷洒桶，然后转移到生物安全柜中。在生物安全柜中打开筒，用干净的摄子从筒中取出离心管，将上清液倾倒于1 个瓶中，然后加入1/6 体积14％的漂白剂处理lh 后丢弃。在纸巾上倒置超离心管，用连接抽真空装置的无菌巴斯德移液管尽可能吸除管壁上的培养基，避免接触管的圆底。

22 使用200μL 带无菌滤芯吸头的微量移液器，加50 ~ 100μL OptiMEM （无P/S)至每个试管的圆底中心，室温下静置5 ~ 10min 。也可用50 ~ 100μL 的PBS 重悬慢病毒载体。吸头轻轻吹打重悬慢病毒载体病毒颗粒，避免产生气泡。另一种方法是在生物安全柜中将管放置在冰上2h, 然后轻轻吹打。

慢病毒载体颗粒是透明的， 在管底很难辨认。但经小心里悬后， 浓缩的慢病毒载体储备液比OptiMEM 稍微混浊。

23 将慢病毒悬液转移到一个0.65mL 无菌管中并混匀。l0μL 分装，储存于－80 °C 。