本文选自nature ，https://doi.org/10.1038/s41586-019-1707-0，喜欢的可以自行下载阅读。

摘要：铁死亡是一种铁依赖的细胞死亡形式，以磷脂的氧化损伤为特征。到目前为止，人们认为铁死亡只受磷脂氢过氧化物还原酶谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)和自由基捕获抗氧化剂的控制。然而，阐明特定细胞类型对铁死亡敏感的因素对于理解铁死亡的病理生理作用和如何利用它是至关重要的。虽然代谢限制和磷脂组成有助于铁死亡的敏感性，但目前还没有发现解释细胞抵抗铁死亡的自主机制。在这里，我们使用了一种表达克隆的方法来鉴定人类癌细胞中能够补充Gpx4缺失的基因。我们发现视黄素蛋白凋亡诱导因子线粒体相关2(AIFM2)是一个以前未被认识抗铁死亡的基因。AIFM2被我们重新命名为铁死亡抑制蛋白1(FSP1)，最初被描述为促凋亡基因，它对Gpx4缺失引起的铁死亡具有保护作用。我们进一步证明，FSP1对铁死亡的抑制是由泛醌(也称为辅酶Q10，CoQ10)介导的：还原形式的泛醌捕获脂质过氧化自由基，而FSP1使用NAD(P)H催化CoQ10的再生。FSP1的药理学靶向与Gpx4抑制剂强烈协同，在许多癌症实体中触发铁死亡。总之，FSP1-CoQ10-NAD(P)H途径是一个独立的平行系统，与Gpx4和谷胱甘肽协同抑制磷脂过氧化和铁死亡。

铁死亡是由硒酶GPX4控制的。随着人们认识到靶向铁死亡可能有助于根除患者中的耐药肿瘤，人们对理解细胞对铁死亡的敏感性的机制越来越感兴趣。尽管酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)被鉴定为铁死亡基因，其表达决定了铁死亡的敏感性，但抑制Gpx4不能在某些癌细胞中引发铁死亡，而不管ACSL4的表达如何，这表明存在替代的耐药机制。

Genetic suppressor screen uncovers FSP1

为了揭示这些因素，我们从MCF7铁死亡抗性细胞系(扩展数据图1A)中产生了一个cDNA表达文库，并筛选了基因弥补Gpx4丢失(图1A)。

这是一个条件性敲除，并用他莫昔芬筛选，开头就是高大上

对14个单细胞克隆的测序确定了7个，表达Gpx4或AIFM2的克隆(扩展数据图1B)。AIFM2是一种黄素蛋白，最初被描述为p53反应基因，并声称基于与另一个最初假设的促凋亡基因的序列相似性而诱导凋亡基因-AIFM1。

因此，为了避免进一步的混淆，我们建议在未来将AIFM2称为铁死亡抑制蛋白1(FSP1)。为了验证，我们在小鼠Pfa1和人纤维肉瘤HT1080细胞中稳定表达了FSP1(扩展数据图1C，d)。

虽然在HT1080敲了

FSP1过表达的细胞受到强大的保护，不受药物和遗传诱导的铁死亡的诱导，并无限增殖(图1B-e，扩展数据图1E-I和补充视频1)。据我们所知，这是第一个弥补GPX419损失的酶系统。

lip-1是抗脂质过氧化的

FSP1的抗铁死亡作用与细胞谷胱甘肽水平、Gpx4活性、ACSL4表达和可氧化脂肪酸含量无关(扩展数据图1C，d，j，k，2)，

PCOOH是一种抗氧化剂

表明FSP1不干扰典型的铁死亡机制。此外，FSP1对细胞死亡的保护作用是铁死亡诱导剂所特有的；FSP1对细胞毒性化合物和/或促凋亡条件引起的细胞死亡没有保护作用。此外，p53状态不影响FSP1的表达(扩展数据图3A-e)。与FSP1相反，AIFM1的过表达未能抑制铁死亡(扩展数据图3f，g)。

表明FSP1细胞保护机制的特异性 AIFM1在铁死亡过程中并没有发挥作用

N-myristoylation enables ferroptosis resistance

我们早期的研究表明，FSP1的N端标记取消了其抗铁死亡活性。事实上，FSP1的N端包含一个典型的肉豆蔻酰化基序，这可能促进了它与脂质双层的结合。在Pfa1和HT1080细胞中表达野生型FSP1和缺乏预测的肉豆蔻酰化位点(G2A)的突变体FSP1(图2A)，以及用烷基官能化肉豆蔻酸模拟物(YnMyr)标记FSP1，使之能够特异性富集野生型FSP1。这种富集在fsp1(G2A)突变体中或用PAN-肉豆蔻酰基转移酶抑制剂IMP-108822处理后被取消(图2B)。FSP1的肉豆蔻酰化似乎是其抗铁死亡活性的关键，因为用IMP-1088处理的FSP1(G2A)和野生型FSP1表达的细胞显示出丧失对铁死亡的抵抗性(图2C，d和扩展数据图3H，I)。

因此，我们使用C末端标记的融合蛋白评估了野生型FSP1和FSP1(G2A)的亚细胞分布。虽然FSP1-GFP定位于一个未指明的核周，但它也与内质网和高尔基体标记部分重叠(图2E和扩展数据图4A)。（有意思，但是在下一篇文章中就是定位于质膜发挥作用）

相反，FSP1(G2A)-GFP分布于整个细胞，表明铁死亡可能是在特定的亚细胞区域驱动的。另一项研究对FSP1的亚细胞定位进行了更深入的研究，该研究揭示了以细胞膜为靶点的FSP1在抑制铁死亡中的显著作用。

FSP1 prevents lipid peroxidation

由于铁死亡是由磷脂过氧化(PLPO)驱动的，我们用BODIPY 581/591C11对Pfa1细胞进行了染色，发现FSP1过表达可钝化(1S，3R)-RSL3(RSL3；图3A)诱导的脂质过氧化（文中表述非常的精确，把脂质过氧化与铁死亡明确区分开来，脂质过氧化是铁死亡的原因，但是并不是脂质过氧化就是铁死亡，有个程度在这里，具体是多少，现在还没有人能够回答，脂质过氧化的检测金标准就是做流式细胞探针检测，没有之一）。此外，在Gpx4敲除FSP1过表达的细胞中，特异性pLPO产物明显较低(图3B和扩展数据图4B)。

检测了多不饱和脂肪酸的产物

由于AIF家族成员已被证明具有NADH：泛醌氧化还原酶活性，我们假设FSP1通过使用NAD(P)H再生亲脂性自由基捕获抗氧化剂来抑制pLPO。还原形式的辅酶q10(coq10-h2)已被报道在磷脂和脂蛋白中是一种很好的捕获自由基的抗氧化剂，但被认为在线粒体外的重要性有限，作为一种有效的再循环机制，辅酶q10(coq10-h2)在磷脂和脂蛋白中是一种很好的捕获自由基的抗氧化剂，但作为一种有效的回收机制，fsp1在线粒体外的重要性是有限的。为了研究FSP1和CoQ10-H2之间的可能联系，我们通过删除4-羟基苯甲酸多戊基转移酶(COQ2)产生CoQ10缺陷的HT1080细胞，COQ2是催化CoQ10生物合成的第一步的酶(图3C)。辅酶Q10缺失的细胞在补充尿苷、辅酶Q10或癸基泛醌时正常增殖(扩展数据图4C)。值得注意的是，虽然FSP1-GFP在亲本HT1080细胞中的过表达抑制了铁死亡，但在COQ2基因敲除细胞中却未能做到这一点(图3D和扩展数据图4D)。

与先前的数据显示，纯化的FSP1减少了可变链长的泛醌类似物，异源表达的FSP1(扩展数据图4e)催化了附加香豆素荧光团的泛醌类似物的还原。这使得能够测定FSP1的动力学参数，与相关的氧化还原酶(例如NQO1(Km=7.9×10−7M和Vmax=6.1×10−9MSs−1)相比，该动力学参数显示出相对较低的米氏常数(Km=1.2×10−5M)和高得多的最大反应速率(Vmax=4.1×10−7MS s−1)。值得注意的是，我们发现脱氢抗坏血酸、氧化谷胱甘肽和叔丁基氢过氧化物不能作为FSP1的底物(图3F)。

为了进一步验证我们的假设，即FSP1通过减少CoQ10抑制pLPO，我们使用亲脂性烷氧基发生器(扩展数据图5A，b)与鸡蛋磷脂酰胆碱和STY-BODIPY进行了联合自氧化实验。

我们发现，FSP1单独或与其还原共底物NAD(P)H结合都不能有效地抑制pLPO(扩展数据图5C)，而CoQ10的加入以剂量依赖的方式大大延迟了鸡蛋磷脂酰胆碱的自氧化(扩展数据图5D，e)。

看不懂

这些结果表明，CoQ10通过FSP1帮助NAD(P)H中的还原物穿梭到脂质双层中，从而抑制脂质过氧化的扩散。在这些测定中，NQO1不能以与FSP1相同的能力提供服务(扩展数据图5f，g)。由于辅酶Q10很容易自氧化，并且在脂质双层内动力学较差，我们想知道α-生育酚是否也有助于防止FSP1-辅酶Q10观察到的铁死亡。因此，在与脂质衍生的过氧化物自由基反应后，α-生育酚既可以通过还原的辅酶Q10再生，也可以直接由FSP1在体外产生，而不需要辅酶Q10(扩展数据图5H-j)。对富含亚油酸的脂质体中磷脂氢过氧化物形成的直接监测证实了共自氧化实验的结果，表明FSP1催化的pLPO在辅酶Q10和α-生育酚存在下进一步增强(扩展数据图5K)。

体外实验太难

Loss of FSP1 sensitizes to ferroptosis

基于FSP1提供的强大保护作用和在没有Gpx4的情况下维持细胞的可能性，我们设想在Gpx4基因敲除或缺失的情况下，FSP1过表达细胞的反筛选野生型背景可能有助于发现FSP1抑制剂。我们筛选了大约10,000个类药物化合物，发现了iFSP1作为一种有效的FSP1抑制剂的鉴定(图4A)。IFSP1选择性地诱导过表达FSP1的Gpx4基因敲除Pfa1和HT1080细胞中的铁死亡(扩展数据图6A，b)。初步的构效关系研究尚未确定比iFSP1有实质性改善的化合物(扩展数据图6C)。

为了确定FSP1是否可以作为癌症中的铁死亡抑制因子，我们产生了一种抗人FSP1的单克隆抗体(扩展数据图6D)，并探索了它与主要的铁死亡蛋白在一组不同来源的人类癌细胞系中的表达(扩展数据图7)。

事实上，FSP1在大多数肿瘤细胞系中都有表达，并且iFSP1治疗使这些细胞对RSL3诱导的铁死亡非常敏感(扩展数据图8)。

作者跟胰腺癌有仇吗？

然后，我们从这些细胞系的选择中产生了FSP1基因敲除和FSP1过表达的细胞(图4b，c和扩展数据图7)，并比较了药理抑制(IFSP1)和FSP1基因敲除在细胞对铁死亡敏感方面的作用。正如预期的那样，FSP1的基因缺失比小分子抑制更有效，而在FSP1敲除背景下的iFSP1治疗对RSL3诱导的铁死亡没有附加效应(扩展数据图6e，f)。

值得注意的是，当FSP1过表达时，少数对RSL3敏感的细胞不能被iFSP1重新增敏。（总体来说，一个蛋白的作用并不是1和0的作用，但是，那0.？的作用其实讨论起来更有意义。）这可能是由于药物代谢和排泄，这些影响应该进一步研究(扩展数据图6f)。详细的实验表明，MDA-MB-436细胞中的FSP1基因敲除降低了它们对RSL3诱导的铁死亡的抵抗力，而小鼠FSP1的重新表达恢复了细胞对铁死亡的抵抗力(图4D，e)。

对癌症依赖图(DepMap；https://depmap.org/portal/))的分析显示，在一组559Gpx4癌细胞系中，FSP1的低表达与Gpx4依赖的增加相关(扩展数据图9A)。此外，在860个癌细胞系(https://portals.broadinstitute.org/ctrp)(扩展数据图9B))中，FSP1的表达与对铁死亡诱导剂RSL3、ML162和ML210的耐药性直接相关。顺铂或其他已知的细胞毒性化合物没有检测到协同细胞死亡(扩展数据图9C，d)，这表明抑制FSP1选择性地使细胞对铁死亡诱导剂敏感。这一发现特别重要，因为耐药肿瘤只对完全消除Gpx4活性有反应；微量的Gpx4足以维持细胞的存活。此外，Gpx4的药理靶向可能只达到部分抗肿瘤作用。事实上，在携带人类异种移植的小鼠中，一项研究表明，H460肿瘤的生长只能通过同时缺失Gpx4和FSP1来减少，而Gpx4单基因敲除的肿瘤生长正常。

我们的数据证明，NADH-FSP1-CoQ10通路是pLPO和铁死亡的有效抑制剂(图4F)。因此，磷脂氧化还原动态平衡可以从谷胱甘肽-Gpx4轴上解离出来，并可以进一步在药理学上利用来有效地使癌细胞对铁死亡诱导剂敏感。我们的发现解释了为什么NAD(P)H和甲羟戊酸途径中的缺陷通过缺失泛醌会聚在FSP1上，从而预测对铁死亡的敏感性。此外，我们的数据为线粒体外辅酶Q10的抗氧化剂角色提供了一个令人信服的案例，并建议应该与FSP1一起进一步研究它的有益作用。

背靠背的另一篇nature 热热乎乎的就要来了。