1. 细菌 Cas9 的原理

(1) 原始状态

cas9_3.png

(2) 改造后的状态

cas9_4.png

(3) 如何编辑 genomic DNA

cas9_5.png

其中 依赖DNA Binding Proteins 的技术有：

DNA_BP.png

蛋白特异性结合DNA后，

(4) 基因操作技术

• DNA 测序
• 限制性内切酶
• PCR
• Genome editing

(5) CRISPR-Cas9 技术

cas9_6.png

(6) Genome editing using CRISPR-Cas9

genome_editing.png

蓝色是自己设计的20bp的gRNA序列；
而切割位点在NGG的上游某个位置，_-20bp之间。

• 细菌中，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。

有两种修复切口的方法：

• 自然修复

• 提供一个外源 template DNA序列，两端和切口配对，中间靠DNA修复机制。

  
  insertion.png

切口位置：

cut_site.png

(7) CRISPR-Cas as a genome editing toolbox

toolbox.png

主要有2个使用方法：

• 基因编辑
• DNA结合蛋白，用于操纵基因组：把切割domain替换为其他分子，
  • 比如启动子来做过表达，
  • GFP来定位基因组三维结构。

2. 一个植物敲除的例子

一个载体上2个gRNA的例子。

cas9_1.png cas9_2.png

3. 更多研究

(1) Testing in vivo editing using SaCas9

几乎每种微生物都有自己的Cas9版本，大小和序列都不一样。
切割效率也不一样。体内测试切割效率。

SaCas9.png

(2) CRISPR 系统的分类

Cas9_classes.png

(3) 如果编辑RNA呢？

edit_RNA.png